[发明专利]一种利用方波电击进行莱茵衣藻高效建库的方法

说明书

一种利用方波电击进行莱茵衣藻高效建库的方法，包括以下步骤：莱茵衣藻在TAP液体培养基，23±0.5°C，连续光照，8000Lx光强下进行通气培养，经过转接后培养、处理，将抗性DNA片段经过方波电击转化，抗性DNA随机整合进入莱茵衣藻染色体中，经过过夜弱光恢复，涂布于抗性筛选平板，经过7天光周期培养，获得引起随机插入突变的突变体文库。此方法的优点是可以高效的获得大量随机插入的转化子，构建莱茵衣藻突变体文库。

技术领域

本发明涉及一种利用方波电击使得外源DNA整合进入莱茵衣藻染色体DNA的方法，特别是一种利用方波电击使得抗性DNA随机插入莱茵衣藻染色体DNA，构建随机插入的莱茵衣藻突变体文库的方法。

背景技术

莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是一种真核单细胞绿藻，因其生长快、易培养，基因组小而且已被注释，生物技术手段相对成熟，细胞内生理过程的分子机制与高等动植物高度相似，因此是目前植物与动物共同的模式生物之一。采用正向遗传学插入突变手段研究表型与基因的关联性，并进一步揭示该基因的生物学功能，是目前较为直接与有效的研究手段。然而该手段的关键在于获得大量可以稳定遗传的DNA片段随机插入的突变体文库，一方面要求单克隆转化子的突变尽可能是单一插入引起，另外一方面要求DNA片段的转化尽可能获得较多的转化子，二者是相互矛盾体，前者要求在做随机插入突变的时候尽可能降低DNA的量，而提高转化子数目除了提高转化效率因素之外，增加DNA的量也可以提高转化子的数目，从而获得数目可观的突变体文库。因此，从提高DNA转化效率入手是目前构建莱茵衣藻突变体文库，或者是开展衣藻转基因技术的根本。

目前的衣藻DNA转化技术中，常用的有玻璃珠转化，电击转化等。Kindle等研究者报道了莱茵衣藻的玻璃珠转化法，该方法将去壁处理的衣藻细胞、DNA、聚乙二醇和玻璃珠震荡混匀，可以获得10³个转化子/微克DNA（Kindle, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences）。因而，早期的玻璃珠转化技术效率较低，操作较复杂，逐渐被摒弃。

电击转化技术被认为是一种最有效的DNA转化技术，最成功的案例是应用在细菌上，可达10^6-10个转化子/微克DNA。另外，RNA、DNA、蛋白质和小分子都可以使用该方法转入酵母，植物细胞与动物细胞，具有重复性好、效率高和细胞的存活率高等优点。Shimogawara等研究者报道了莱茵衣藻的电击转化方法，该方法对于细胞壁缺陷细胞CC3395的转化效率高达1.9×10⁵个，然而没有检测野生型衣藻的转化效率（Shimogawara, 1998, Genetics）。同样的，Ladygin研究发现使用细胞壁缺陷CW-15衣藻电击转化获得10³个/5 ug DNA（Ladygin, 2003,Microbiology）。而方波电击转化技术比指数衰减波更具有良好的重复性，对细胞损伤小等特点，然而目前使用该系统电击转化莱茵衣藻的报道还很少，效率还不够高。Takashi等研究者使用方波电击仪NEPA21，采用衰减型，高低压与正反极组合变化的方式对野生型C-9莱茵衣藻细胞进行电击转化，具体参数为①高压250 V，8 ms，50 ms间隔，衰减40%为150 V，8ms；②低压20 V，衰减40%，50 ms间隔，10次（后五次电极方向相反），将2k抗性片段经过转化可以获得3380个转化子/ug DNA，C-9去细胞壁后使得其转化效率翻倍；利用相同的电击参数电击转化其他野生型莱茵衣藻CC-124，CC-125，CC-1690（21gr），分别获得转化子的数目是2930个转化子/ug DNA，404个转化子/ug DNA，3400个转化子/ug DNA。如果将长片段7.8kb片段DNA进行转化，则效率下降至500个转化子/ug DNA（Takashi,2012, Journal of Bioscience and Bioengineering）。