[发明专利]一种利用方波电击进行莱茵衣藻高效建库的方法

权利要求书

1.一种利用方波电击进行莱茵衣藻高效建库的方法，其特征在于，莱茵衣藻在TAP液体培养基，23±0.5℃，连续光照，8000Lx光强下进行通气培养，经过转接后培养、处理，将抗性DNA片段经过方波电击转化，抗性DNA随机整合进入莱茵衣藻染色体中，经过过夜弱光恢复，涂布于抗性筛选平板，经过7天光周期培养，获得引起随机插入突变的突变体文库；

所述的方波电击条件为使用BTXECM830电击仪，设置参数电压500V，电击时间4ms，电击波段6-7次，每次电击时间间隔100ms，电击完毕冰浴放置10min;

所述的莱茵衣藻即实验藻种：21gr（CC1690），属于莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）的一个品系；

所述TAP液体培养基为：TAP盐溶液25ml/L，磷酸盐溶液0.375ml/L，Hutner微量元素1ml/L，乙酸1ml/L，Tris2.42g/L，121°C高压蒸汽灭菌20min；

所述的TAP盐溶液为：NH₄Cl15g/L,MgSO₄·7H₂O4g/L,CaCl₂·2H₂O2g/L；

所述的磷酸盐溶液为：K₂HPO₄ 288g/L,KH₂PO₄144g/L；Hutner微量元素为：EDTA二钠盐50g/L,ZnSO₄·7H₂O22g/L,H₃BO₃11.4g/L,MnCl2·4H₂O5.06g/L,CoCl·6H₂O1.61g/L,CuSO4·5H₂O1.57g/L,(NH₄)6Mo7O₂₄·4H₂O1.1g/L,FeSO₄·7H₂O4.99g/L，用KOH或者HCl调节pH至7.0；

所述的抗性DNA片段为从pJMG-aphVIII质粒中，经过内切酶EcoRI酶切、回收获得抗巴龙霉素片段，检测后定量为每个转化加入100ng；所述的抗性筛选平板为上述TAP液体培养基的配方中加入琼脂粉15g/L，进行121°C高压蒸汽灭菌20min，冷却至约55°C后添加巴龙霉素，使其终浓度为10ug/ml，倒平板备用；所述的涂布抗性筛选平板为衣藻细胞沉淀悬液与制备好的20%淀粉溶液混匀，1ml/平板涂布均匀，并保持无菌，所述的20%淀粉溶液为依次经过70%乙醇洗涤、TAP+60mM山梨醇溶液洗涤，并用该溶液重悬后，加入终浓度为0.4%PEG6000的淀粉溶液。