[发明专利]一种检测植物自噬现象的基因定位表达载体及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及检测细胞自噬现象的基因载体的构建，并利用所述基因定位表达载体研究细胞自噬现象。

背景技术

自噬(Autophagy)是细胞内一项重要的降解机制，通过自噬可将细胞内衰老蛋白质运送至溶酶体进行降解。细胞自噬现象广泛存在于大多数真核生物包括酵母、果蝇、植物及人体的细胞中，是细胞循环利用自身已损坏蛋白质、细胞器中所包含的氨基酸等营养物质的一种重要方式，也是真核生物进化过程中形成的一种对环境的适应。

细胞自噬的过程可大致分为四个阶段：一，细胞接收到如饥饿、营养因子缺乏或病虫害侵袭等自噬诱导信号后，胞浆中产生一定量的扁平游离双层磷脂膜结构，围绕在待降解物周围；二，膜结构不断延伸，将胞浆、细胞器等待降解物包绕起来，形成封闭的自噬体；三，自噬体通过细胞骨架微管网络系统运输至溶酶体内并与之融合形成自噬溶酶体；四，形成自噬溶酶体后，自噬体的膜结构被降解，降解产物被运输至胞浆中待重新利用，残渣被滞留在胞浆中或被转运出细胞。近年来的研究表明在植物病虫害感染过程中，自噬发挥了很大恶作用，即使没有任何异常蛋白的存在，失去自噬作用就可以导致疾病的发生。一些自噬相关基因(Autophagyrelatedgene，Atg)的表达对自噬调控的成熟有重要作用，在自噬体形成的不同阶段，不同的Atg对其进行不同的调控。

Atg8在酵母、拟南芥中是极其保守的。有实验表明，在真核生物中，Atg5-Atg12编码的蛋白复合体参与了自噬体的形成；Atg8-磷脂酰乙醇胺复合体控制了自噬体的膨胀。已有关于酵母和哺乳动物的研究表明Atg8及其同源基因可以明确地定位自噬体并因此成为自噬现象的标记基因。在植物中，也不乏有关Atg8基因的研究。Su等从水稻中克隆了OsAtg8，并通过实验证明了Atg8的接合通路功能在水稻中是保守的，因此推断该基因很可能在水稻自噬系统中发挥了重要作用。可以肯定的是，Atg8基因在自噬过程中发挥了重要的作用，但要明确Atg8参与自噬的形成的一系列分子机理，目前仍缺少相关的鉴定和检测材料。

发明内容

本发明提供一种检测真核生物细胞自噬现象和自噬小体的基因定位表达载体，所述基因载体包含一个在烟草中发现的有关自噬现象、参与自噬体形成的保守同源基因NtAtg8和一个标记荧光蛋白的基因GFP作为报告基因。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种检测植物自噬现象的基因定位表达载体的构建方法，以红花大金元烟草品种为材料，提取RNA，反转录得cDNA，以NtAtg8-F/NtAtg8-R为引物对，进行PCR扩增NtAtg8基因，双酶切体系处理DNA片段并回收，采用同样的双酶切体系处理pFF19-GFP质粒并回收；将含有同样粘性末端的NtAtg8基因和pFF19-GFP载体进行连接，连接产物转化到DH5α感受态细胞中，挑选阳性菌落测序验证。

所述NtAtg8基因和pFF19-GFP载体连接的体系为：酶切后质粒各1μl、Buffer1μl、T4连接酶1μl，补水至10μl，16℃连接过夜。

所述NtAtg8-F/NtAtg8-R引物对序列如SEQIDNO：1/SEQIDNO：2所示，其中GGTACC为KpnI酶切位点，GGATCC为BamHI酶切位点。

所述NtAtg8基因的片段如SEQIDNO：3所示。

所述NtAtg8基因翻译的融合蛋白氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。

所述PCR扩增的反应条件如下：94℃预变性5min，94℃30s，62℃30s，72℃40s，35个循环，再72℃10min，16℃10min，4℃保存。

所述双酶切体系为：BufferK2.5μL，BamHI2.5μL，SphI2.5μL，模板20μL，加灭菌水至50μL。

一种检测植物自噬现象的基因定位表达载体的应用，将NtAtg8-pFF19-GFP质粒转入烟草悬浮细胞，通过激光共聚焦显微镜观察悬浮细胞，定位自噬体。

所述将质粒转入烟草悬浮细胞的方法为基因枪介导转化法。

所述基因定位表达载体在分析植物细胞自噬分子机理的应用。

本发明的有益效果在于：利用本发明构建的载体，使其蛋白与目的基因标记的蛋白融合后在悬浮细胞中表达，通过激光共聚焦显微镜检测融合蛋白的位置而进行的亚细胞定位，是一种简便而又准确的在活细胞中进行定位的方法，为研究烟草细胞自噬现象的分子机理提供参考依据。

附图说明