[发明专利]一种检测植物自噬现象的基因定位表达载体及应用在审
| 申请号： | 201610017008.8 | 申请日： | 2016-01-08 |
| 公开（公告）号： | CN105441470A | 公开（公告）日： | 2016-03-30 |
| 发明（设计）人： | 周会娜;陈千思;刘萍萍;陈霞;金立锋;翟妞;郑庆霞;张慧;林福呈;徐国云 | 申请（专利权）人： | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 |
| 主分类号： | C12N15/66 | 分类号： | C12N15/66;G01N21/64 |
| 代理公司： | 郑州优盾知识产权代理有限公司 41125 | 代理人： | 郑园;张真真 |
| 地址： | 450001 河南省*** | 国省代码： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 检测 植物 现象 基因 定位 表达 载体 应用 | ||
1.一种检测植物自噬现象的基因定位表达载体的构建方法，其特征在于：以红花大金元烟草品种为材料，提取RNA，反转录得cDNA，以NtAtg8-F/NtAtg8-R为引物对，进行PCR扩增NtAtg8基因，双酶切体系处理DNA片段并回收，采用同样的双酶切体系处理pFF19-GFP质粒并回收；将含有同样粘性末端的NtAtg8基因和pFF19-GFP载体进行连接，连接产物转化到DH5α感受态细胞中，挑选阳性菌落测序验证。
2.如权利要求1所述的检测植物自噬现象的基因定位表达载体的构建方法，其特征在于：所述NtAtg8基因和pFF19-GFP载体连接的体系为酶切后质粒各1μl、Buffer1μl、T4连接酶1μl，补水至10μl，16℃连接过夜。
3.如权利要求1所述的检测植物自噬现象的基因定位表达载体的构建方法，其特征在于：所述NtAtg8-F/NtAtg8-R引物对序列如SEQIDNO：1/SEQIDNO：2所示，其中GGTACC为KpnI酶切位点，GGATCC为BamHI酶切位点。
4.如权利要求1所述的检测植物自噬现象的基因定位表达载体的构建方法，其特征在于：所述NtAtg8基因的片段如SEQIDNO：3所示。
5.如权利要求1所述的检测植物自噬现象的基因定位表达载体的构建方法，其特征在于：所述NtAtg8基因翻译的融合蛋白氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。
6.如权利要求1所述的检测植物自噬现象的基因定位表达载体的构建方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应条件如下：94℃预变性5min，94℃30s，62℃30s，72℃40s，35个循环，再72℃10min，16℃10min，4℃保存。
7.如权利要求1所述的检测植物自噬现象的基因定位表达载体的构建方法，其特征在于：所述双酶切体系为：BufferK2.5μL，BamHI2.5μL，SphI2.5μL，模板20μL，加灭菌水至50μL。
8.一种检测植物自噬现象的基因定位表达载体的应用，其特征在于：将NtAtg8-pFF19-GFP质粒转入烟草悬浮细胞，通过激光共聚焦显微镜观察悬浮细胞，定位自噬体。
9.如权利要求6所述的检测植物自噬现象的基因定位表达载体的应用，其特征在于：所述将质粒转入烟草悬浮细胞的方法为基因枪介导转化法。
10.如权利要求6所述的检测植物自噬现象的基因定位表达载体的应用，其特征在于：所述基因定位表达载体在分析植物细胞自噬分子机理的应用。
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