[发明专利]一种鸡TGFBR2基因甲基化检测方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，提供了一种鸡TGFBR2基因甲基化检测方法及其应 用。

背景技术

鸡肠炎沙门氏菌病是家禽生产中的常见疾病，肠炎沙门氏菌能够透过蛋壳进入鸡 蛋产品中，且能在生殖道中寄存繁殖。之前有报道，美洲等发达国家中发生的食物中毒事 件，大多数是由禽类的沙门氏菌而引起的，而其中，起主要作用的病原就是肠炎沙门氏菌。 肠炎沙门氏菌对家禽生产造成重大影响，引起畜禽发病，而且是食源性致病菌，能通过家禽 副产品给人类的健康带来很大的威胁，是报道最频繁的致病微生物之一；表观遗传修饰尤 其是基因的甲基化在在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育、肿瘤癌症及相关疾病发生 中起着重要调控作用，而基因启动子区域的甲基化能够通过调控基因的表达影响各种疾病 的发生发展进程。

甲基化是基因表达调控的重要模式，TGFBR2基因可通过启动子区域的高甲基化而 丧失活性，在多种疾病发生过程中发挥表达调控作用；目前尚没有关于鸡TGFBR2基因甲基 化检测方法，以及TGFBR2基因在鸡肠炎沙门氏菌感染中发挥的甲基化调控作用的报道。

发明内容

本发明的发明人针对上述现有技术的情况，结合长期研究和探索，提供了一种鸡 TGFBR2基因甲基化检测方法及其应用，该方法提供了鸡TGFBR2基因甲基化检测的特异性引 物及配合该引物使用的巢式PCR条件，利用上述引物和方法，可以准确检测鸡感染肠炎沙门 氏菌后TGFBR2基因中的甲基化情况，并可以以此作为分子标记为鸡抗肠炎沙门氏菌感染提 供理论依据。

发明人提供的具体技术方案如下：

一种鸡TGFBR2基因甲基化检测方法，所采用的方法为巢式PCR，所采用的鸡TGFBR2 基因特异性的甲基化引物，其序列如下表所示：

上述引物前一对为第一对引物，后一对为第二对引物，利用上述2对特异性引物对 经亚硫酸盐对修饰处理后的鸡的全基因组基因DNA进行巢式PCR，2次反应条件一致，其PCR 扩增反应体系如下，每20μL体系为：

PCR扩增条件为：

其中所述的亚硫酸盐修饰处理采用QIAGEN公司甲基化修饰试剂盒对鸡基因组DNA 进行亚硫酸盐修饰处理，使未发生甲基化的胞嘧啶转换成尿嘧啶，而发生甲基化位点因5′- 甲基胞嘧啶的保护而不发生变化。

而上述的PCR扩增条件也根据本发明的目的进行了对应调整，是在众多备选条件 中优选出的最佳条件，可配合本发明的特异性引物起到最佳的检测效果。

所获得的扩增产物进行大肠杆菌克隆，转化成功后直接进行测序，测序结果显示， 肠炎沙门氏菌感染后TGFBR2基因中所检测各CpG位点的甲基化受到激活，利用这一特性，可 以作为肠炎沙门氏菌感染的甲基化分子标记。

基于上述理由，利用本发明所述的鸡TGFBR2基因甲基化检测方法检测待测鸡群， 可以作为鸡抗肠炎沙门氏菌感染提供可靠的依据，并将其应用与养殖生产实践中。

综上所述，本发明的发明人首次提供了一种鸡TGFBR2基因甲基化检测方法及其应 用，该方法提供了鸡TGFBR2基因甲基化检测的特异性引物及配合该引物使用的巢式PCR条 件，利用上述引物和方法，可以准确检测鸡感染肠炎沙门氏菌后TGFBR2基因中的甲基化情 况，并可以以此作为分子标记为鸡抗肠炎沙门氏菌感染提供理论依据。

具体实施方式

下述实施例中除特殊说明之外，所采用的均为本领域现有技术；

实施例1

一种鸡TGFBR2基因甲基化检测方法，所采用的方法为巢式PCR，所采用的鸡TGFBR2 基因特异性的甲基化引物，其序列如下表所示：

选择肠炎沙门氏菌阴性的寿光鸡6-10只，试验组口服接种含菌量为10⁹cfu的肠炎 沙门氏菌菌液0.3mL，对照组接种0.3mLPBS缓冲液，接种后14日采集盲肠样品，提取基因组 DNA，试验组和对照组各取3-5只。

用QIAGEN公司甲基化修饰试剂盒对鸡基因组DNA进行亚硫酸盐修饰处理，使未发 生甲基化的胞嘧啶位置转换成尿嘧啶，而发生甲基化位点因5′-甲基胞嘧啶的保护而不发 生变化。