[发明专利]同时定量南美白对虾中两种致病菌活菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及水产品中食源性致病菌的检测方法，具体涉及一种同时定量南美 白对虾中两种致病菌活菌的方法。

背景技术

副溶血性弧菌和沙门氏菌是水产品中两种重要的食源性致病菌，给公众健康 造成了极大的安全隐患。在中国，副溶血性弧菌是水产品中头号食源性致病菌， 因为消费生的或未煮熟的水产品极易感染副溶血性弧菌，从而造成严重的急性肠 胃炎，并伴随有恶心、头疼、低烧等症状。沙门氏菌是引起海产品食物中毒事件 发生的第二大食源性致病菌，每年约有20.8％的海产品食物中毒事件是由该菌引 起的。

南美白对虾是南亚和东南亚部分地区最为重要的水产品，同时，因为其味道 鲜美、营养丰富，也是这些区域的最受欢迎的食品之一。但是，副溶血性弧菌和 沙门氏菌在对虾中的检出率逐年上升，已经成为生鲜对虾食用安全的重要影响因 素。因此，构建一种快速、精准和高效的方法用于南美白对虾中这两种食源性致 病菌的定量检测，对于水产品工业的健康发展和公众卫生状况的改善具有极为重 要的意义。

使用传统方法定量检测食品中的这两种食源性致病，包括增菌富集、选择性 培养基的分离以及生理生化鉴定等多个复杂的步骤，需要5～7天的时间。相比 于传统方法，荧光定量PCR是一种更加快速、高效、省力的方法，已被广泛应用 于食品中多种食源性致病菌的快速定量检测。为了获得更高的效率，不少研究构 建了多重荧光定量PCR的方法，该方法可同时定量检测食品中两种及两种以上的 食源性致病菌。然而，无论是荧光定量PCR还是多重荧光定量PCR技术都存在一 个极大的缺陷，基于DNA的检测方法无法区分样品中的死、活菌，常导致假阳性 现象，从而过高估计了样品中致病菌的数量。

叠氮溴化丙锭(Propidiummonoazide，PMA)是一种对核酸具有高度亲和力 的光敏反应染料，能够进入细菌的死细胞中，选择性地交联死菌的DNA，将其与 DNA扩增检测技术相结合，可有效地抑制死菌细胞DNA的扩增。近年来，利用PMA 结合荧光定量PCR技术，已经广泛应用于多种食源性致病菌的活菌检测，例如副 溶血性弧菌、单增李斯特菌、空肠弯曲菌、沙门氏菌、大肠杆菌等重要的食源性 致病菌，被认为是目前最为有效的新型活菌检测技术。然而，研究表明该新型活 菌检测方法仍存在一定的技术难点，其区分死活菌的能力常受到多种因素的影 响，例如菌株、PMA浓度、暗处理时间、PCR扩增体系以及样品基质等。因此， 目前将PMA与多重实时荧光PCR相结合的研究仍鲜少被报道，成为高通量活菌 定量检测的热点和难点问题。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供了一种同时定量南美 白对虾中两种致病菌活菌的方法。本发明旨在于构建一种新型快速的活菌定量技 术，结合PMA和多重荧光定量PCR的优点，同时定量检测生鲜南美白对虾中活的 副溶血性弧菌和沙门氏菌。这一方法创新地将多重荧光定量PCR技术和PMA染料 相结合，达到了快速定量南美白对虾中两种重要致病菌活菌的目的，以期提供一 种有效的技术支持用于改善水产品安全和保护公众的健康。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种同时定量南美白对虾中两种致病菌活菌的方法，所述方法包 括如下步骤：

S1、将叠氮溴化丙锭母液加入待测的南美白对虾虾液匀浆中，获得叠氮溴化 丙锭-样品混合液；暗处理后曝光，高速离心，收集菌体；

S2、对所述菌体进行DNA提取；

S3、以提取得到的DNA为模板，以副溶血性弧菌的t1h基因和沙门氏菌的 orgC基因作为靶基因，进行多重荧光定量PCR扩增反应，输出相应的循环阈值；

S4、将所述循环阈值分别与副溶血性弧菌标准曲线、沙门氏菌标准曲线进行 对照，获得副溶血性弧菌和沙门氏菌的活菌浓度。

优选的，步骤S1中，所述叠氮溴化丙锭母液的制备包括：每1mg叠氮溴化 丙锭溶解于980μLddH₂O中获得2mM的母液，并于-20℃下避光保存。

优选的，步骤S1中，所述南美白对虾虾液匀浆是在每225ml蛋白胨水中加 入25g生鲜南美白对虾，均质处理2～5min而得。