[发明专利]同时定量南美白对虾中两种致病菌活菌的方法

权利要求书

1.一种同时定量南美白对虾中两种致病菌活菌的方法，其特征在于，所述 方法包括如下步骤：

S1、将叠氮溴化丙锭母液加入待测的南美白对虾虾液匀浆中，获得叠氮溴化 丙锭-样品混合液；暗处理后曝光，高速离心，收集菌体；

S2、对所述菌体进行DNA提取；

S3、以提取得到的DNA为模板，以副溶血性弧菌的tlh基因和沙门氏菌的 orgC基因作为靶基因，进行多重荧光定量PCR扩增反应，输出相应的循环阈值；

S4、将所述循环阈值分别与副溶血性弧菌标准曲线、沙门氏菌标准曲线进行 对照，获得副溶血性弧菌和沙门氏菌的活菌浓度。

2.根据权利要求1所述的同时定量南美白对虾中两种致病菌活菌的方法， 其特征在于，步骤S1中，所述叠氮溴化丙锭母液的制备包括：每1mg叠氮溴化 丙锭溶解于980μLddH₂O中获得2mM的母液，并于-20℃下避光保存。

3.根据权利要求1所述的同时定量南美白对虾中两种致病菌活菌的方法， 其特征在于，步骤S1中，所述南美白对虾虾液匀浆是在每225ml蛋白胨水中加 入25g生鲜南美白对虾，均质处理2～5min而得。

4.根据权利要求1所述的同时定量南美白对虾中两种致病菌活菌的方法， 其特征在于，步骤S1中，所述叠氮溴化丙锭-样品混合液中叠氮溴化丙锭的浓度 为100μM，暗处理的时间为15～20min，曝光的时间为15～20min。

5.根据权利要求1所述的同时定量南美白对虾中两种致病菌活菌的方法， 其特征在于，步骤S2中，所述提取是按照天根细菌基因组DNA提取试剂盒的说 明书进行的。

6.根据权利要求1所述的同时定量南美白对虾中两种致病菌活菌的方法， 其特征在于，步骤S3中，所述多重荧光定量PCR扩增反应采用的副溶血性弧菌 正引物的序列如SEQIDNO.1所示，副溶血性弧菌反引物的序列如SEQIDNO.2 所示，沙门氏菌正引物的序列如SEQIDNO.3所示，沙门氏菌反引物的序列如 SEQIDNO.4所示。

7.根据权利要求1所述的同时定量南美白对虾中两种致病菌活菌的方法， 其特征在于，步骤S3中，所述多重荧光定量PCR扩增反应中，副溶血性弧菌探 针标记FAM作为报告基团，其序列如SEQIDNO.5所示；沙门氏菌探针标记HEX 作为报告基团，其序列如SEQIDNO.6所示。

8.根据权利要求1、6或7所述的同时定量南美白对虾中两种致病菌活菌的 方法，其特征在于，所述多重荧光定量PCR扩增反应体系为每20μL，包括2μ L10×PCRBuffer、1.2μL浓度为50mM的MgSO₄溶液、0.5μL浓度为10mM 的dNTPsmix溶液、0.2μL浓度为5U/μL的TaqDNA聚合酶、0.5μL浓度 为10μM的副溶血性弧菌正引物和反引物、0.5μL浓度为10μM的沙门氏菌 正引物和反引物、0.2μL浓度为10μM的副溶血性弧菌探针、0.2μL浓度为 10μM的沙门氏菌探针、DNA模板1μL以及ddH₂O12.7μL。

9.根据权利要求1所述的同时定量南美白对虾中两种致病菌活菌的方法， 其特征在于，所述多重荧光定量PCR扩增反应的条件为：95℃预变性2min，95℃ 变性15s，60℃退火1min，进行40个循环。

10.根据权利要求1所述的同时定量南美白对虾中两种致病菌活菌的方法， 其特征在于，步骤S4中，所述副溶血性弧菌标准曲线是以已知副溶血性弧菌活 菌浓度的南美白对虾虾液匀浆为对象，利用其菌落计数的结果和多重荧光定量 PCR输出的Ct值构建的标准曲线；所述沙门氏菌标准曲线是以已知沙门氏菌活 菌浓度的南美白对虾虾液匀浆为对象，利用其菌落计数的结果和多重荧光定量 PCR输出的Ct值构建的标准曲线。