[发明专利]用于无抗生素发酵制备低分子量物质和蛋白质的微生物菌株和方法

说明书

本发明涉及微生物菌株和用于物抗生素发酵制备低分子量物质和蛋白质的方法。用于生产低分子量物质或蛋白质的微生物菌株在其基因组中含有基因中的突变，所述突变在所述菌株中引起营养缺陷。其进一步含有编码酶或重组蛋白和基因的功能性拷贝的生产质粒，所述酶用于生产低分子量物质，所述基因的染色体失活引起营养缺陷，其中所述营养缺陷是不可补足的营养缺陷。

本发明涉及用于无抗生素发酵生产低分子量物质和蛋白质的微生物菌株和方法。

首要地，借助于微生物的低分子量物质的自然生产已经增多，重组蛋白药物(“生物制剂”)的市场近年来也呈现强劲增长。由于发酵生产(特别是对于基于蛋白质的活性药物成分)中的高成本压力，正在寻求更有效且因此更具成本效益的用于其生产的方法和系统。各种微生物，如细菌、酵母、丝状真菌或其它植物细胞或动物细胞均可用作生产者。在此，从经济角度来看至关重要的是经济有效的发酵、高产物产量及在蛋白质的情况中的获得功能性蛋白质的正确折叠和/或修饰。由于其经广泛研究的遗传学和生理学、短的传代时间和简便处理，革兰氏阴性肠杆菌大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)是目前最常用于生产低分子量物质和蛋白质的生物体。

基本上，使用两种不同的微生物：天然产生所述物质的微生物及已经遗传修饰的微生物。遗传修饰所需的技术方法在现有技术中已久为人所知。在此的目标是将靶蛋白质需要的或者合成低分子量物质需要的基因导入宿主细胞。所述基因由宿主细胞转录、翻译、必要时修饰，且可能向外转移到培养基中。

生物技术方法的经济可行性关键取决于所得产物的产量。所述产量可以通过表达系统(宿主细胞，遗传元件等)、发酵参数和培养基而优化。

基本上，宿主细胞可以通过两种不同的方式进行修饰。从而，可以将新的遗传信息整合进基因组(丝状真菌，酵母等)和/或导入染色体外元件上(例如质粒)(原核生物，酵母等)。在将基因遗传整合进基因组中的情况中，即使没有选择压力，所述基因在宿主细胞中仍然良好保持。然而，缺点是在原核生物情况中，宿主中只有一个基因拷贝，且由于序列特异性重组事件，整合相同基因的进一步的拷贝，以通过基因-剂量效应增加产物形成是非常具有挑战性的(EP 0284126B1)。

当使用染色体外DNA时，通常将质粒形式的靶蛋白的遗传信息转化进大肠杆菌生产菌株中。由于基因-剂量效应在此也产生作用，因此争取尽可能最高的每个细胞的质粒拷贝数。由于这种遗传因子因胁迫而容易从细胞丢失(归因于质粒的复制以及靶蛋白的产生)，因此有必要对整个培养施加选择压力。标准的是使用抗生素抗性基因作为选择标记，这使得包含这种元件的细胞在抗生素存在下能够生长。因此，只有携带质粒的细胞可以繁殖。由于产生靶物质或靶蛋白质的能力也由于质粒丢失而丧失，这对于在发酵中可以达到的产量有直接影响。

近年来，使用抗生素抗性作为选择标记越来越受到关注。首先，抗生素的使用相当昂贵，尤其是当抗性基于抗生素降解酶时，因为需要不断提供额外剂量的抗生素。其次，在医学和其它领域的广泛使用促成抗性基因扩散到其它菌株，在某些情况中是致病性菌株。这对疾病的治疗具有负面影响。

同时，现有技术中也开发了无抗生素选择系统。已经开发了多种不同的无抗生素系统。这些可以分为三种不同的基本系统。使用营养缺陷型、毒素-抗毒素系统及其它方法。

其它方法的类别涵盖不遵循一般原理的机制，例如抑制因子tRNA、fab I/三氯生(FA合成)、操纵子/阻抑物滴定(Peubez et al.Microbial Cell Fac,2010,9:65)。然而，这些方法通常用于合成用于基因治疗的DNA和DNA片段，未优化用于产生高产量的靶物质。在一些情况中，代替抗生素用于选择的是其它物质，例如三氯生、除草剂和重金属，但也会引起健康问题。例如Herrero et al.(1990,J.Bacteriol.172,6557–6567)描述了作为选择标记的除草剂和重金属抗性基因。