[发明专利]基于具有靶扩增的信号放大DNA级联反应的检测方法

说明书

用于检测样品中的靶核酸的方法、组合物和试剂盒。该方法包括：在聚合酶和核酸内切酶的存在下，使样品与以下物质接触：第一寡核苷酸，其沿5’至3’方向包括第一信号DNA生成序列、核酸内切酶识别位点、和与靶核酸的3'末端互补的序列；第二寡核苷酸，其沿5’至3’方向包括第二信号DNA生成序列、核酸内切酶识别位点、和与第一寡核苷酸的第一信号DNA生成序列同源的序列；第三寡核苷酸，其沿5’至3’方向包括第三信号DNA生成序列、核酸内切酶识别位点、和与第二寡核苷酸的第二信号DNA生成序列同源的序列。所述反应形成信号级联。所述聚合酶优选地具有链置换活性，并且所述靶核酸优选为微RNA。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2014年12月24日提交的序列号为62/096,640的美国临时专利申请的优先权，其全部内容在此通过引用并入本文。

序列表

该申请包括序列表，其通过引用而并入，并且作为以“12351US01_SeqListToFile.TXT”命名的文本文件与本申请一起提交。序列表文件创建于2015年12月24日，并且有3522字节的容量。

基金

【不适用】

背景技术

检测试样中的靶核酸在多个领域(包括医学和生物学)中都是重要的。许多组合物、测定平台以及方法可用于检测特异性核酸分子。为了使检测可重现和准确，这些方法需要足够的选择性和灵敏度，以允许检测以低浓度存在的核酸分子。

一种用于从混合核酸序列群扩增特定序列的常用方法是聚合酶链式反应(PCR)。由于典型的PCR在三个不同的温度下进行，所以反应可能涉及挑战，例如难以保持精确的温度，以及时间损失与扩增循环数成比例地增加。双链模板DNA变性为单链(虽然在一定程度上依赖于特定序列)通常需要使用高“解链”温度，这限制了可用于那些高度耐热的DNA聚合酶的类别。因此，已经开发了等温扩增平台技术以在比PCR中使用的反应条件更温和的反应条件下检测核酸。然而，这些等温扩增技术具有由非特异性扩增事件和高背景信号所呈现的挑战，以及在低浓度下检测靶核酸的选择性和灵敏度方面的挑战。

以下公开内容提供了用于在比PCR中使用的反应条件更不严苛的反应条件下检测核酸序列(例如DNA或RNA)的替代方法和组合物。该方法和组合物保持了允许检测在样品中可以为低浓度的核酸分子和/或长度短的核酸分子的序列选择性和灵敏度。在其它方面，本公开提供了能够在低温、等温条件下提高样品中靶核酸的检测限的新方法和核酸分子，并且能够简化或改进样品制备和自动化检测方法。

发明内容

在一方面，本公开涉及用于检测样品中的靶核酸的方法，其中靶核酸与第一寡核苷酸(序列转化DNA或SC DNA)的相互作用生成第一信号DNA(S1)，第一信号DNA(S1)进而与第二寡核苷酸(级联信号放大DNA 1或cSA DNA 1)相互作用以生成与S1不同的第二信号DNA(S2)，S2进而能够与第三寡核苷酸(级联信号放大DNA 2或cSA DNA 2)相互作用以生成第三独特信号DNA(S3)。第三独特信号DNA S3能够与第四寡核苷酸(级联信号放大DNA 3或cSADNA3)相互作用以生成第四独特信号DNA(S4)，S4进而能够与第五寡核苷酸(级联信号放大DNA 4或cSA DNA 4)相互作用以生成第五独特信号DNA(S5)，S5进而能够与第六寡核苷酸(级联信号放大DNA 5或cSADNA 5)相互作用以生成第六独特信号DNA(S5)，等等，直到达到所期望的扩增。