[发明专利]从多个引物测序以增加数据速率和密度

权利要求书

1.用于测定核酸序列的方法，其包括：

提供与支持物结合的至少一个核酸；

将至少两个引物与核酸的相同链杂交；

在允许杂交的条件下在存在下列各项的情况下将所述核酸与酶接触：(i)能够在不同位置处与所述至少一个核酸的相同链杂交的至少两个引物，和(ii)四个标记的部分，其各自包含至少一个选自dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、和dATP的核苷酸类似物，所述四个标记的部分的每个具有不同于其他三个标记的部分的独特标记物的独特标记物；

在所述至少两个引物中的每个处在所述核酸的相同链上进行引物延伸以给出多个延伸读段，每个延伸读段从所述至少两个引物之一延伸，其中相同组的四个标记的部分用于每个延伸读段；

获得对应于每次引物延伸时掺入的至少一个核苷酸碱基的信号数据；

从所述信号数据测定所述核酸碱基的身份并将所述碱基分配至延伸读段；其中所述至少两个引物包含不同水平的封闭和未封闭的引物，从而通过使读段之一比另一个更亮而化学区分每个延伸读段。

2.权利要求1的方法，其中所述方法包括除去未结合的标记的部分的步骤。

3.权利要求1或2的方法，其中所述多个延伸读段包含同时的延伸读段。

4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述四个标记的部分各包含选自dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、和dATP的可逆终止剂类似物。

5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述酶包含聚合酶或连接酶。

6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述支持物包含芯片或珠。

7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述独特标记物包含染料、荧光团、生色团、组合荧光能量转移标签、质量标签，或电泳团。

8.前述权利要求中任一项的方法，其中至少两个引物具有重叠序列。

9.前述权利要求中任一项的方法，其中至少两个引物相差单个碱基添加。

10.前述权利要求中任一项的方法，其中生物信息学信息用于将碱基分配给所述延伸读段。

11.前述权利要求中任一项的方法，其中同时获得对应于所述至少两个引物延伸中每个的所述信号数据。

12.权利要求1至10中任一项的方法，其中测定所述核苷酸碱基的身份的步骤包括分析对应于在所述多个延伸读段中每个上检测的独特标记物的信号强度概况。

13.前述权利要求中任一项的方法，其中所述信号数据包括一个或多个图像。

14.权利要求13的方法，其中所述信号数据以对应于所述引物延伸上掺入的多个核苷酸类似物的颜色信号检测，并且其中每个颜色信号对应于不同核苷酸类似物或核苷酸类似物的组合。

15.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法包括信号处理步骤，所述步骤包括信号去卷积、信号改良，和信号选择的一个或多个。

16.前述权利要求中任一项的方法，其中在每个杂交循环时做出多个碱基调用。

17.前述权利要求中任一项的方法，其中将所述碱基分配至延伸读段的步骤包括测定所述核苷酸碱基的位置。

18.前述权利要求中任一项的方法，其中将所述碱基分配至延伸读段的步骤包括为每个延伸读段提供初步碱基调用和最终碱基调用。

19.权利要求18的方法，其中通过将初步碱基调用数据与参考基因组比较来提供最终碱基调用。