[发明专利]用于检测高毒力艰难梭菌菌株的存在的方法

说明书

本发明提供了在生物样品中检测高毒力艰难梭菌菌株的基于核酸扩增的方法。本发明基于对高毒力艰难梭菌基因组中阴性和阳性标志物特异的寡核苷酸引物和探针的用途。

本发明涉及基于核酸扩增的诊断测定领域。更具体地，本发明提供了在生物样品中(如粪样品中)检测高毒力艰难梭菌菌株(优选为毒素生产性艰难梭菌菌株027)的基于PCR的方法。本发明基于对高毒力艰难梭菌菌株中阴性和阳性标志物特异的寡核苷酸引物和探针的用途。

发明背景

艰难梭菌感染(CDI)是一种毒素介导的肠道疾病。CDI的临床结果可以从无症状定殖(colonization)变化到更严重的疾病综合征，包括严重腹泻，腹痛，发烧和白细胞增多。艰难梭菌被认为是住院治疗和抗生素治疗后患者发生的感染性腹泻的主要原因。因此，CDI现在被认为是最重要的保健相关感染之一。此外，还出现了非医院相关的艰难梭菌库(reservoirs)，并且艰难梭菌能够在动物宿主中传播(Denéve et al.，2009；Rupnik etal，2009)。

目前，艰难梭菌检测方法包括细胞毒素产生(cytotoxigenic)培养法、对由艰难梭菌产生的毒素A和毒素B检测的细胞毒素测定(CYT)，对艰难梭菌tcdB基因检测的基于PCR的测定，和对艰难梭菌特异性谷氨酸脱氢酶(GDH)检测的测定(Eastwood et al.，2009)。

在现有技术中，已经发现基于PCR的测试是快速筛选和鉴定含有艰难梭菌的样品的可靠、灵敏和特异的诊断工具(Eastwood et al.，2009；Hirvonen et al.，2013；Houseret al.，2010和WO2012087135)。商业使用中的是由WO2010116290(Philips)公开的方法，其涉及通过分析细胞毒素tcdB基因以及tcdC基因中的缺失的存在或缺少来检测产毒的艰难梭菌菌株的多重PCR测定。

虽然已经公开了用于检测毒素生产性艰难梭菌菌株的多个基于PCR的测定方法，但在本领域中仍然需要能够为检测那些高毒力艰难梭菌菌株提供高特异性和可靠性的PCR测定。本发明人现在已经在艰难梭菌基因组中定位了DNA序列区域，其令人惊讶地非常适合用于与高毒力艰难梭菌菌株相关的阴性和阳性标志物的特异性和灵敏性扩增。

样品基质(sample matrix)(其在腹泻诊断中通常是粪或食物样品)可能含有许多PCR抑制剂。这降低了PCR反应的扩增效率并因此对扩增子设计步骤预期更为细致的优化以验证所有模板和拷贝数被等量扩增，但也足够有效。因此，需要实现高PCR效率(最佳是尽可能接近100％)的寡核苷酸设计。所用的检测方法还可以影响扩增效率和/或偏爱。

本发明人现在已经定位了DNA序列区域，该区域完全适合用于引起腹泻的高毒力艰难梭菌菌株的特异性和灵敏性扩增和定量。扩增子被设计为是如此特异的，使得它们可以彼此组合成任何多重集合。自然地，这点的先决条件是所有公开的扩增子也已被设计为在相同的反应和循环条件下进行扩增。本发明的目的是替代作为用于高毒力艰难梭菌筛选测试的抗原测试和培养，并因此通过快速提供丰富的信息集提供方法改善，实现在改善的患者管理中的实验室和临床益处。此外，如果临床微生物实验室能够容易地区分非产毒的艰难梭菌和高毒力艰难梭菌，则感染控制能够获益。

发明概述

本发明的一个目的在于提供在生物样品中检测高毒力艰难梭菌菌株的存在的方法，所述方法包括：

进行核酸扩增反应，其包含自所述生物样品提取的DNA作为模板、在所述反应中对于扩增艰难梭菌hydR基因中目标序列特异性的第一寡核苷酸引物组、和在所述反应中对于扩增对应于SEQ ID NO：2所列的艰难梭菌序列的目标序列的至少部分特异性的第二寡核苷酸引物组，其中所述hydR基因包含对应于SEQ ID NO：1的序列。