[发明专利]基于CRISPR的组合物和使用方法

说明书

本发明涉及用于CRISPR系统中的修饰的组合物和其使用方法。特别地，描述了crRNA和tracrRNA的长度修饰和化学修饰形式，用作与CRIPSR系统的Cas9相互作用的重构的向导RNA。所得crRNA和tracrRNA的长度修饰和化学修饰形式可经济地生产，并且可以剪裁以具有与其在CRIPSR Cas9核酸内切酶系统背景中的生物化学和生物活性相关的独特性质。

相关申请的交叉引用

本申请依据35U.S.C.119要求2014年12月18日和2015年10月9日提交并且名称为“基于CRISPR的组合物和使用方法(CRISPR-BASED COMPOSITIONS AND METHODS OF USE)”的美国临时专利申请序列号62/093,588和62/239,546的优先权，所述临时专利申请的内容通过引用整体并入本文。

序列表

本申请包含序列表，其已经通过EFS-Web以ASCII格式提交并且通过引用整体并入本文。ASCII拷贝创建于2015年12月18日，命名为IDT01-008-US_ST25.txt，并且大小为177,163字节。

技术领域

本发明涉及用于CRISPR系统中的修饰的组合物，和其使用方法。

背景技术

使用成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)和相关的Cas蛋白(CRISPR-Cas系统)进行位点特异性DNA切割对于许多生物学应用显示出巨大的潜力。CRISPR被用于基因组编辑；转录阻遏因子(CRISPRi)和激活因子(CRISPRa)的基因组规模特异性靶向内源基因；以及利用Cas酶的RNA向导DNA靶向的其它应用。

CRISPR-Cas系统产生自细菌和古细菌，以提供针对病毒和质粒的适应性免疫。有三类可能潜在适用于研究和治疗性试剂的CRISPR-Cas系统，但是II型CRISPR系统在具有具有理想特征，利用单一CRISPR相关(Cas)核酸酶(特别是Cas9)与适当的向导RNA的复合物(与包含CRISPR激活RNA:反式激活crRNA(crRNA:tracrRNA)对的细菌中的天然复合物类似的2部分RNA系统或人工嵌合单向导RNA(sgRNA))介导目标DNA的双链切割。在哺乳动物系统中，已通过在体外转录后转染含有驱动RNA转录的RNA Pol III启动子(例如U6或H1)、病毒载体和单链RNA的DNA盒，引入了这些RNA(参见Xu,T.等,《应用与环境微生物学(ApplEnviron Microbiol)》,2014.80(5):第1544-52页)。

在CRISPR-Cas9系统中，使用例如以化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)中存在的系统为例(S.py.或Spy)，天然crRNA长度为约42bp，含有与目标序列(也称为前间区序列(protospacer))互补的约20个碱基的5'区和通常约22个碱基长度的对应于tracrRNA序列的互补区的3'区。天然tracrRNA长度为约85-90个碱基，具有含有与crRNA互补的区域的5'区以及5'上游的约10个碱基区。tracrRNA的其余3'区包括二级结构(在本文中称为“tracrRNA 3'尾”)。

Jinek等广泛研究了CRISPR-Cas9系统正常运作所需的crRNA和tracrRNA的部分(《科学(Science)》,2012.337(6096):第816-21页)。他们设计了仍可在CRISPR-Cas9中起作用的截短的crRNA:tracrRNA片段，其中crRNA是野生型42个核苷酸并且tracrRNA被截短到75个核苷酸。他们还开发了一种实施方案，其中crRNA和tracrRNA利用接头环连接，形成单向导RNA(sgRNA)，其在不同的实施方案中在99-123个核苷酸之间变化。天然的2部分crRNA:tracrRNA复合物的构型示于图1中，并且人工sgRNA单向导的99个核苷酸实施方案示于图2中。