[发明专利]用于改善的蛋白质产生的组合物和方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2014年8月15日提交的美国临时专利申请序列号62/038,095的优先权，其全文以引用方式并入本文。

序列表

根据37C.F.R.§1.52(e)通过EFS提交的序列表以引用方式并入本文。通过EFS提交的序列表文本文件包含于2015年7月10日创建的、大小为44千字节的文件“40456-WO-PCT_ST25.txt”。

技术领域

本公开的方面涉及改善来自宿主细胞的分泌性铜酶(cuproenzyme)的表达的方法，其通过操纵一种或多种铜金属伴侣蛋白，例如膜结合的铜转运ATP酶和可溶性铜转运蛋白的表达水平实现。本公开还提供包含此类经过改善的宿主细胞的组合物以及由包含一种或多种感兴趣的铜酶的经过改善的宿主细胞制备的产物。

介绍

铜是具有氧化还原活性的过渡金属，其为多种酶(在本文称为铜酶)的必需辅因子。然而，由于其毒性，细胞中游离铜的含量必须保持在低水平。因此，少于总细胞铜的0.01％在细胞质中是游离的；大多数铜被金属硫蛋白所结合和螯合以防止其细胞毒性作用。此外，细胞中的不同区室具有不同的铜含量，其中线粒体具有比细胞质更高的铜含量，细胞质继而比高尔基体具有更高的含量。

在用于在已工程化以过表达一种或多种功能性铜酶的重组宿主细胞中产生此类酶的工业环境中，细胞中的游离铜的有限可用性是有问题的。由于以上指出的细胞铜梯度，在生产分泌性铜酶时，这一问题尤其明显。然而，在宿主细胞培养期间以实现正确平衡提供额外的铜是一个相当大的技术挑战，所述平衡即：促进功能性和分泌性铜酶的产生，而不会变得对宿主细胞有毒性。

除了与由宿主细胞产生铜酶相关的问题之外，对于从工厂排放的废水中允许的铜含量也有规定。因此，可向铜酶发酵过程添加的铜的量也存在上限。

因此，需要研发重组宿主细胞和使用此类宿主细胞来改善铜酶在发酵过程中的产生的方法。

发明内容

本发明的方面至少部分地基于以下发现：一种或多种铜金属伴侣蛋白在期望的重组宿主细胞，例如丝状真菌宿主细胞中的增加的表达可改善分泌性铜酶在宿主细胞中的产生。因此，本文提供了在基本上相同的培养条件下，与不具有一种或多种铜金属伴侣蛋白的增加表达的亲本宿主细胞相比，表现出改善的铜酶产生/分泌的具有一种或多种铜金属伴侣蛋白的增加表达的重组宿主细胞。还提供了由这些宿主细胞产生铜酶的方法以及包含由此类宿主细胞产生的铜酶的组合物。可用于主题组合物和方法的分泌性铜酶的示例包括但不限于：裂解性多糖单加氧酶(LPMO)、漆酶、酪氨酸酶、胺氧化酶、胆红素氧化酶、儿茶酚氧化酶、多巴胺β-单加氧酶、半乳糖氧化酶、己糖氧化酶、L-抗坏血酸氧化酶、肽基甘氨酸单加氧酶、多酚氧化酶、槲皮素2,3-双氧化酶、以及过氧化物歧化酶。

本发明的方面包括但不限于以下：

1.一种用于由宿主细胞产生铜酶的方法，包括：在表达铜酶的宿主细胞中过表达铜金属伴侣蛋白，以及在足以产生铜酶的条件下培养宿主细胞，其中当在基本上相同的培养条件下培养时，与不过表达铜金属伴侣蛋白的相应宿主细胞相比，所述宿主细胞产生增大量的铜酶。

2.根据1所述的方法，其中铜酶是从宿主细胞中分泌的。

3.根据1或2所述的方法，其中铜酶选自由以下项构成的组：裂解性多糖单加氧酶(LPMO)、漆酶、酪氨酸酶、胺氧化酶、胆红素氧化酶、儿茶酚氧化酶、多巴胺β-单加氧酶、半乳糖氧化酶、己糖氧化酶、L-抗坏血酸氧化酶、肽基甘氨酸单加氧酶、多酚氧化酶、槲皮素2,3-双氧化酶、以及过氧化物歧化酶。

4.根据以上任一项所述的方法，其中铜酶与宿主细胞是内源的。

5.根据以上任一项所述的方法，其中铜酶与宿主细胞是异源的。

6.根据以上任一项所述的方法，其中通过源自宿主细胞的启动子控制铜酶和/或铜金属伴侣蛋白的表达。