[发明专利]核酸酶介导的DNA组装

权利要求书

1.一种用于组装两个或多个核酸的方法，包括：

(a)使第一核酸与第一核酸酶试剂接触，其中所述第一核酸酶试剂包含Cas蛋白和向导RNA(gRNA)(gRNA-Cas复合物)、锌指核酸酶或转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)；其中所述第一核酸酶试剂在第一靶位点处切割所述第一核酸，以产生具有重叠末端序列的第一经酶切的核酸，所述重叠末端序列为第二核酸所共有；

(b)使所述第一经酶切的核酸和所述第二核酸与核酸外切酶接触，以暴露所述第一经酶切的核酸与所述第二核酸之间的互补序列；以及

(c)组装由步骤(b)生成的所述两个核酸片段。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)包括：

(i)使所述暴露的互补序列退火；

(ii)延伸所述经退火的互补序列的3’端；以及

(iii)连接所述第一核酸和所述第二核酸。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中两个或多个核酸是双链。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(a)还包括使所述第二核酸与第二核酸酶试剂接触，其中所述第二核酸酶试剂在第二靶位点处切割所述第二核酸，以产生第二经酶切的核酸，所述第二经酶切的核酸具有所述重叠末端序列，并且，

其中步骤(b)的所述第二核酸是所述第二经酶切的核酸。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一核酸酶试剂包含所述Cas蛋白和gRNA，

其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白，所述gRNA包含编码成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)的核酸序列，并且所述第一靶位点被前间区序列邻近基序(PAM)序列紧邻地侧接。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述Cas9蛋白包含RuvC结构域和HNH结构域，两个结构域中的至少一者缺少核酸内切酶活性。

7.根据权利要求1、2、6中任一项所述的方法，其中所述重叠末端序列的长度在20bp至200bp的范围内。

8.根据权利要求1、2、6中任一项所述的方法，其中所述第一核酸、所述第二核酸或这两个核酸衍生自细菌人工染色体。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述细菌人工染色体包含啮齿动物DNA、合成DNA、人多核苷酸序列或它们的组合。

10.一种用于组装两个或更多个核酸的方法，包括：

(a)使第一核酸与至少一种核酸酶试剂接触，其中所述至少一种核酸酶试剂包含Cas蛋白和向导RNA(gRNA)(gRNA-Cas复合物)、锌指核酸酶或转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)，其中所述至少一种核酸酶试剂在第一靶位点处切割所述第一核酸，以生成第一经酶切的核酸；

(b)使所述第一经酶切的核酸与第二核酸、接合寡核苷酸和核酸外切酶接触，

其中所述接合寡核苷酸包含：

(i)与所述第一经酶切的核酸互补的第一互补序列；

(ii)间区序列；以及

(iii)与所述第二核酸互补的第二互补序列；

其中所述核酸外切酶使所述第一互补序列和所述第二互补序列暴露；以及

(c)将所述接合寡核苷酸与所述第一经酶切的核酸和所述第二核酸组装在一起。

11.根据权利要求10所述的方法，其中步骤(c)中的组装包括：

(i)使所述接合寡核苷酸的所述第一互补序列退火到所述第一经酶切的核酸上，并使所述接合寡核苷酸的所述第二互补序列退火到所述第二核酸上；以及

(ii)将所述接合寡核苷酸连接到所述第一经酶切的核酸和所述第二核酸。

12.根据权利要求11所述的方法，其中步骤(i)还包括延伸所述第一经酶切的核酸和/或所述第二核酸的3’端。