[发明专利]一种蔗糖异构酶突变体及其生产异麦芽酮糖的方法

说明书

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及定点突变获得一种蔗糖异构酶从而提高其产物特异性，以及通过制备固定化蔗糖异构酶并利用非水相催化体系实现固定化酶的分离。本发明中所提供的蔗糖异构酶其催化产物中异麦芽酮糖的含量大幅度提高，从90.28％升至99.16％，酶的制备过程易于实施且产酶效率高；蔗糖异构酶固定化技术有助于蔗糖异构酶在反复催化过程中保持较高的催化活性和极低的酶量损失，可以进行多批次的连续使用，可以大大降低操作难度，节约经济成本。

技术领域：

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及定点突变获得一种蔗糖异构酶从而提高其产物特异性，以及通过制备固定化蔗糖异构酶并利用非水相催化体系实现固定化酶的分离。

背景技术：

异麦芽酮糖(Isomaltulose)，也称帕拉金糖(Palatinose)，是一种还原性双糖，是蔗糖的同分异构体，1957年，由Weidenhagen等人在甜菜制作中首先发现。异麦芽酮糖具有与蔗糖类似的甜味特性和口感，但其甜度低，仅为蔗糖的52％，与蔗糖相比，其突出的优点主要体现在：(1)低致龋齿特性；(2)适合糖尿病人食用；(3)在人肠道中，选择性刺激双歧杆菌的生长；(4)极低的吸湿性，稳定性强，货架期也更长。作为一种有前途的功能性甜味剂，异麦芽酮糖已在日本、美国、西欧等国家得到广泛应用，应用范围包括硬糖、软糖、口香糖、巧克力、焙烤食品、水果罐头、果酱、运动饮料和牙膏等。另外，异麦芽酮糖也是异麦芽酮糖醇(Isomalt)的原料。异麦芽酮糖醇是近年来国际上新兴的一种功能性糖醇，广泛应用于无糖食品、无糖保健品和无糖药品等产品的生产上。

异麦芽酮糖由蔗糖异构酶EC 5.4.99.22(Sucrose isomerase)，或叫异麦芽酮糖合成酶(Isomaltulose syntheses)，蔗糖葡萄糖基变位酶(Sucrose glucosylmutase)，α-葡萄糖基转移酶(α-glucosyltransferase)催化蔗糖转变而成。目前，用于异麦芽酮糖生产的蔗糖异构酶来源于各种微生物，如沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假单胞菌属(Psedumonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、农杆菌属(Agrobacterium)和精朊杆菌属等(Protaminobacter)。美国专利No.4390627、4670387、4857461、5229276和5336617分别描述了以上一种或几种微生物来源的蔗糖异构酶的固定化酶或固定化细胞生产异麦芽酮糖。虽然上述几种细菌产的蔗糖异构酶能够把蔗糖转变成异麦芽酮糖，但产量很不稳定，转化率也不高，为8％～85％。而且，除了主产物外，酶转化液中还存在部分海藻酮糖和少量的异麦芽糖、异松三糖、葡萄糖和果糖等副产物，产物特异性不高。近年来，中国也有一些相关专利，如中国专利CN101200750A，一种大黄欧文氏菌及其在制备异麦芽酮糖中的应用，该发明可使蔗糖转化率高达99.5％(w/w)，异麦芽酮糖转化率达90％。中国专利CN1434861A，克雷伯氏菌属的细菌分离物以及从其中分离的异麦芽酮糖合成酶基因，该发明涉及一种新菌种的两个菌株，即新加坡克雷伯氏菌(Klebsiella singaporensis)LX3及LX21。还涉及编码一种新型异麦芽酮糖合酶KIS的核苷酸序列(kis)。还涉及在植物中产生异麦芽酮糖的方法，此方法包括在该植株细胞中引入一种编码将蔗糖转化成异麦芽酮糖的核酸序列，从而使得转化细胞表达所述的核酸序列。以上专利所公开的生产异麦芽酮糖技术工艺，采用游离的菌体或游离酶转化蔗糖溶液提高了效率，但由于回收困难致使成本增加，酶的使用寿命较短，不利于生产的连续化。

针对上述游离菌体或游离酶的缺陷，许多学者对固定化技术进行了大量的研究。目前采用海藻酸钠进行固定化的方法已经成功地应用于工业化生产异麦芽酮糖中，但海藻酸钠固定化方法在生产中实际操作中存在以下几个问题：1、固定化操作程序多，效率低；2、固定化菌体的强度不够大，易破碎引起菌体的脱落；3、固定化过程中产生大量废弃物，造成浪费和污染。而固定化酶具有储存稳定性高、易于分离回收、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等优点，不仅在化学生物学、生物工程医学及生命科学等领域异常活跃，而且具有节省能源与资源、减少污染的生成。