[发明专利]一种蔗糖异构酶突变体及其生产异麦芽酮糖的方法

权利要求书

1.一种蔗糖异构酶突变体，其特征在于，所述突变体其氨基酸序列如SEQ ID No.11所示。

2.权利要求1所述蔗糖异构酶突变体的编码基因。

3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如核苷酸序列表SEQ IDNo.10所示。

4.一种包含权利要求3所述的基因的克隆载体、表达载体或宿主细胞。

5.权利要求4所述的克隆载体、表达载体或宿主细胞，其特征在于，所述的克隆载体为pMD18-T simple、所述的表达载体为pHY-WZX、所述的宿主细胞为地衣芽孢杆菌CBB3008。

6.权利要求1所述的蔗糖异构酶突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将权利要求2所述的基因酶切、连接到pHY-WZX载体，得到重组质粒；

(2)所述的重组质粒转化至地衣芽孢杆菌CBB3008，得到重组菌株；

(3)表达所述的重组菌株，纯化获得如SEQ ID NO：11所示的蔗糖异构酶突变体。

7.权利要求1所述的蔗糖异构酶突变体或权利要求2所述的基因的用途，其特征在于，用于高特异性的催化蔗糖生成异麦芽酮糖。

8.如权利要求7所述的权利要求1所述的蔗糖异构酶突变体或权利要求2所述的基因的用途，其特征在于，所述催化蔗糖生成异麦芽酮糖的方法具体如下：

按每Kg蔗糖干重加入制备好的蔗糖异构酶10000U～20000U，将蔗糖异构酶加入到质量体积比为20～50％的蔗糖溶液中，控制反应液在pH 4.0～7.0，温度在30～60℃，搅拌速度在200r/min的条件下反应4～12h，反应完成后，异麦芽酮糖合成率可达100％。

9.如权利要求8所述的权利要求1所述的蔗糖异构酶突变体或权利要求2所述的基因的用途，其特征在于，所述蔗糖异构酶为游离酶。

10.如权利要求8所述的权利要求1所述的蔗糖异构酶突变体或权利要求2所述的基因的用途，其特征在于，所述蔗糖异构酶为固定化酶；所述反应液中还加入用于固定化载体及固定化酶回收的萃取液。

11.如权利要求10所述的权利要求1所述的蔗糖异构酶突变体或权利要求2所述的基因的用途，其特征在于，所述萃取液为乙酸丁酯，甲酸乙酯，乙酸甲酯，乙酸乙酯，乙酸丙酯，己酸乙酯，己酸己酯，环己烷，正己烷，正庚烷，正辛烷中的一种。

12.如权利要求10所述的权利要求1所述的蔗糖异构酶突变体或权利要求2所述的基因的用途，其特征在于，所述萃取液与蔗糖溶液的体积比为10:90。

13.如权利要求10所述的权利要求1所述的蔗糖异构酶突变体或权利要求2所述的基因的用途，其特征在于，所述固定化酶的制备方法如下：

(1)固定化载体预处理：载体1～15g，加入2～60mL浓度为1M，pH为pH 4.0～9.0的K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液，20℃～45℃震荡摇晃1h，抽滤，再重复以上操作2～4遍；

(2)配制蔗糖异构酶液：将权利要求1所述蔗糖异构酶0.1～3g溶解于pH 5.0～7.0的浓度为2M的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，并使终体积为10mL，收集含蔗糖异构酶的溶解液；

(3)蔗糖异构酶的固定化：将步骤(2)配制的蔗糖异构酶溶解液中加入步骤(1)预处理好的固定化载体1g，于15℃～80℃，200r/min摇床反应24h，收集反应液，进行抽滤，弃滤液，收集滤渣，用pH3.8～7.9的0.2M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液洗涤滤渣2～5次，收集洗涤渣，对于收集的洗涤渣，干燥后保存于4℃～15℃冰箱，即制备出固定化蔗糖异构酶。