[发明专利]TERC基因和/或MYC基因检测探针及其制备方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术，特别是涉及TERC(ERBB2)基因和/或MYC基因检测探针及其制备方法和试剂盒。

背景技术

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤。从正常宫颈、宫颈上皮内瘤变到宫颈癌是一个逐渐发展的过程，其发生、发展与多种基因和蛋白质的异常表达或缺失密切相关，是一个复杂的多步骤过程。在子宫颈癌的治疗过程中发现，针对宫颈癌的治疗效果与病理分级相关，CIN及早期宫颈癌(包括原位癌和早期浸润癌)的治疗效果非常好，治疗措施得当，可长期无瘤生存。因此，宫颈癌的早期诊断和准确分级在宫颈癌的防治中非常重要。人类端粒酶RNA(telomeraseRNAcomponent，，TERC)是人类端粒酶的主要组成部份，TERC基因的突变、活化及扩增将导致端粒酶活性的增强。原癌基因MYC(v-mycavianmyelocytomatosisviraloncogenehomolog,MYC)是MYC家族的重要成员，编码细胞核内磷酸化蛋白质。MYC基因是细胞增殖的主要调节基因，其表达的增强可以启动细胞的非控制性增值过程，从而促使大多数人类肿瘤的发生。研究发现，与正常宫颈和低度宫颈癌前病变(CIN1)相比，TERC基因和MYC基因的扩增频率随着宫颈病变的进展而加强，提示检测TERC/MYC基因状态可以辅助临床区分高度与低度宫颈癌前病变，提高细胞学及HPV检测筛查宫颈病变的灵敏度及特异性。

荧光原位杂交(FluorescenceinsituhybridizationFISH)是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。FISH的基本原理是用已知的标记核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。

杂交所用的探针大致可以分类三类：1)染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2)全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3)特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。

探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp左右的片段。而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，临床使用方便。

而目前对于TERC基因和/或MYC基因FISH检测，还缺少灵敏度和特异性高的检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种TERC基因和/或MYC基因检测探针及其制备方法，所制备的探针可用于检测TERC基因和MYC基因状态，即检测TERC基因和MYC基因的指拷贝数变化，具有很好的特异性。

实现上述目的的技术方案如下。

一种TERC基因和/或MYC基因检测探针的制备方法，包括以下步骤：

(4)选取针对TERC基因的BAC克隆为CTD-3214J12、RP11-816J6和RP11-778I3中至少一种，或选取BAC克隆为RP11-3K16、CTD-2582E13和RP11-886J24中的至少一种；和/或选取针对MYC基因的BAC克隆为CTD-2511O8，或选取BAC克隆为RP11-440N18和CTD-2205H22中的至少一种；

(5)对克隆分别提取质粒，得到质粒DNA，定量；

(6)用荧光素标记质粒DNA，针对同一种基因的质粒DNA所标记的荧光素相同，针对TERC基因和针对MYC基因的检测探针标记的荧光素的颜色不相同，即得。

在其中一个实施例中，针对TERC基因的所述BAC克隆为CTD-3214J12、RP11-816J6和RP11-778I3。