[发明专利]一株产L-苹果酸的酿酒酵母工程菌的构建及应用

权利要求书

1.一株产L-苹果酸的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌过表达来源于Aspergillus flavus的丙酮酸羧化酶基因Afpyc、苹果酸脱氢酶基因Afmdh和苹果酸转运蛋白基因Afmae。

2.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述丙酮酸羧化酶基因的氨基酸序列与NCBI上accession numble：XM_002377040的基因编码的氨基酸序列一致；所述苹果酸脱氢酶基因的氨基酸序列与NCBI上accession numble：XM_002378178的基因编码的氨基酸序列一致；所述苹果酸转运蛋白基因的氨基酸序列与NCBI上accession numble：XM_002376564的基因编码的氨基酸序列一致。

3.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述过表达Afpyc是以PY14载体进行游离表达；所述过表达Afmae和Afmdh，是将这两个基因连接到PY26载体上进行游离表达。

4.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述Aspergillus flavus是Aspergillus flavus ATCC13697。

5.一种权利要求1所述酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)PCR扩增或者化学合成核苷酸序列分别如XM_002377040、XM_002378178、XM_002376564所示的Afpyc片段、Afmdh片段、Afmae片段；

(2)将Afpyc片段连接到质粒PY14上得到重组质粒PY14/TEF-Afpyc，将Afmae片段和Afmdh片段先后连接到质粒PY26上得到重组质粒PY26/GPD-Afmae TEF-Afmdh；并验证；

(3)将上一步得到的两个重组质粒，转化到酿酒酵母宿主中，涂布Ura及Trp缺陷平板进行筛选；

(4)验证正确的重组菌，即为产L-苹果酸的酿酒酵母工程菌。

6.权利要求1所述酿酒酵母工程菌在发酵生产L-苹果酸方面的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用是将酿酒酵母工程菌活化后，于温度30℃、转速800rpm，通气量1.5vvm，调节pH至5.0以下进行发酵，发酵时间为84h。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述发酵使用的发酵培养基含有：葡萄糖100g/L，K₂SO₄ 6.6g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，尿嘧啶、色氨酸终浓度20mg/L，尿素终浓度1g/L，生物素终浓度为1mg/L，CaCl₂·2H₂O终浓度为5mM，微量金属离子液1mL/L，维生素液1mL/L；所述微量金属离子液，按mg/L计，含有：EDTA 15，ZnSO₄·7H₂O 4.5，CoCl₂·6H₂O 0.3，MnCl₂·4H₂O 1，CuSO₄·5H₂O 0.3，CaCl₂·2H₂O 4.5，FeSO₄·7H₂O 3，NaMoO₄₂·2H₂O 0.4，H₃BO₃ 1，KI0.1；所述维生素液，按mg/L计，含有：生物素0.05，泛酸钙1，烟酸1，肌醇25，盐酸硫胺素1，盐酸吡哆醇1，对氨基苯甲酸0.2。