[发明专利]一种简单高效的干细胞贴片制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，以羊膜作为生物支架材料，用于干细胞的贴壁生长， 用于临床糖尿病足创面的修复，具体是一种简单高效的干细胞贴片制备方法。

背景技术

组织工程是近年来正在兴起的一门新学科，其研究内容主要包括四个方面：种 子细胞、生物材料、构建组织和器官的方法和技术以及组织工程的临床应用，核心 是建立细胞与生物材料的三维空间复合体，即具有生命力的活体组织，用以对病损 组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代，因此，支架材料的选择是组 织工程中的重要环节，也是限制组织工程临床应用的重要因素。理想的支架材料应 具有：1.具有良好的生物相容性，使细胞可黏附和增殖，且无明显的细胞毒性和炎 症反应，不影响新组织的功能；2.可降解性，其降解吸收速率与细胞、组织的生长 速率相匹配；3.合适的孔径，以利于大量细胞的贴壁和细胞外基质的形成；4.合适的 机械强度；5.无抗原性及致瘤性。

研究显示，在人羊膜细胞外基质上负载培养的角膜细胞、结膜细胞、成纤维细 胞、软骨细胞等均能良好生长，并保持原有的细胞形态及功能。羊膜从细胞滋养层 衍化而来，为无血管、神经及淋巴，具有一定韧性和弹性的半透明膜。Bourne扫描 电镜下，羊膜可分为上皮层、基底膜、致密层、纤维母细胞层、海绵层五层结构， 其中，羊膜的基底膜含有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型胶原，纤维连接蛋白、层粘连蛋白 等，丰富的胶原纤维增强了羊膜的抗拉能力，为细胞生长提供了足够的三维空间结 构，有利于细胞在羊膜上黏附和生长，且人羊膜细胞不表达人白细胞A、B、C或 DR抗原，具有抗原性极低，免疫排斥反应小的特点。此外，羊膜具有良好的生物 相容性，同时也是一种易得的生物材料，易于加工、处理和运输，为组织工程学的 研究提供了便利的条件，目前广泛用于眼科、临床烧伤外科及骨科等皮肤、黏膜、 神经重建移植的研究中。

间充质干细胞具有多能分化潜能，能够被募集在皮肤损伤缺血区和创伤组织中， 同时能

够分泌多种细胞因子及炎性因子，促进血管的再生和细胞外基质的重建，为创 面局部创造一个良好的修复环境，促进创面的修复。目前，临床上主要通过静脉或 肌肉注射干细胞治疗糖尿病足，取得了较好的效果，干细胞疗法最为新兴的治疗手 段，在糖尿病足的治疗中已经发挥了其独特的优势及潜力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单高效的干细胞贴片制备方法，利用本发明配制 的上皮细胞消化液，使上皮细胞的去除过程方便、快捷，大大缩短整个操作过程所 需的时间。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种简单高效的干细胞贴片制备方法，步骤如下：

一、羊膜组织的获取及前处理；

二、羊膜上皮细胞的消化与刮除；

三、羊膜上皮细胞消化后的鉴定；

四、制备干细胞贴片。

2、根据权利要求1所述的简单高效的干细胞贴片制备方法，其特征在于：所述 羊膜组织的获取及前处理的步骤如下：

⑴取健康剖腹产产妇胎盘，用胶体金、荧光定量PCR的方法检测产妇血清HbsAg， 抗-HCV，HCV-RNA,抗-HDV，抗HEV，抗-HIV-1/2，HIV-1-RNA,CMV-DNA，检测结果 均为阴性的胎盘方可使用；

⑵将胎盘装入无菌采样袋中，密封后4℃条件下进行运输；

⑶对装有胎盘的采样袋外包装进行彻底的酒精消毒后，放入生物安全柜中

⑷将胎盘从无菌袋中取出，放置于无菌不锈钢盆中，脐带面向上；

⑸用眼科剪刀沿脐带根部与胎盘连接处轻轻剪出一个小口，双手持眼用镊子分离 胎盘的羊膜层与绒毛膜层；

⑹将分离得到的羊膜放入PH7.2的PBS缓冲液中，清洗羊膜组织3次，彻底将 羊膜组织上的血凝块、血管清洗感觉，羊膜呈半透明状为止；

⑺将羊膜上皮细胞面向上，平铺到合适大小的硝酸纤维素膜上，形成羊膜-硝酸 纤维素膜复合体

⑻用无菌眼科剪将羊膜-硝酸纤维素膜复合体剪成约8.0cm*8.0cm大小的小块

而且，所述刮除羊膜上皮细胞的消化和刮除具体步骤如下：

⑴羊膜上皮细胞消化液的配制：将0.4％胰蛋白酶，0.05％乙二胺四乙酸，0.027％ 磷酸二氢钾，0.142％磷酸氢二钠溶于1000毫升去离子水中，充分溶解后用0.22μm 的过滤装置过滤除菌，4℃保存；