[发明专利]一种简单高效的干细胞贴片制备方法

权利要求书

1.一种简单高效的干细胞贴片制备方法，其特征在于：步骤如下：

一、羊膜组织的获取及前处理；

二、羊膜上皮细胞的消化与刮除；

三、羊膜上皮细胞消化后的鉴定；

四、制备干细胞贴片。

2.根据权利要求1所述的简单高效的干细胞贴片制备方法，其特征在于：所述羊膜组织的获取及前处理的步骤如下：

⑴取健康剖腹产产妇胎盘，用胶体金、荧光定量PCR的方法检测产妇血清HbsAg，抗-HCV，HCV-RNA,抗-HDV，抗HEV，抗-HIV-1/2，HIV-1-RNA,CMV-DNA，检测结果均为阴性的胎盘方可使用；

⑵将胎盘装入无菌采样袋中，密封后4℃条件下进行运输；

⑶对装有胎盘的采样袋外包装进行彻底的酒精消毒后，放入生物安全柜中；

⑷将胎盘从无菌袋中取出，放置于无菌不锈钢盆中，脐带面向上；

⑸用眼科剪刀沿脐带根部与胎盘连接处轻轻剪出一个小口，双手持眼用镊子分离胎盘的羊膜层与绒毛膜层；

⑹将分离得到的羊膜放入PH7.2的PBS缓冲液中，清洗羊膜组织3次，彻底将羊膜组织上的血凝块、血管清洗感觉，羊膜呈半透明状为止；

⑺将羊膜上皮细胞面向上，平铺到合适大小的硝酸纤维素膜上，形成羊膜-硝酸纤维素膜复合体

⑻用无菌眼科剪将羊膜-硝酸纤维素膜复合体剪成约8.0cm*8.0cm大小的小块。

3.根据权利要求1所述的简单高效的干细胞贴片制备方法，其特征在于：所述羊膜上皮细胞的消化与刮除的具体步骤如下：

⑴羊膜上皮细胞消化液的配制：将0.4％胰蛋白酶，0.05％乙二胺四乙酸，0.027％磷酸二氢钾，0.142％磷酸氢二钠溶于1000毫升去离子水中，充分溶解后用0.22μm的过滤装置过滤除菌，4℃保存；

⑵将羊膜-硝酸纤维素膜复合体平铺于无菌培养皿中，加入配制好的羊膜上皮细胞消化液，使消化液能完全覆盖羊膜上表面

⑶将培养皿置于5％CO₂培养箱中，37℃孵育30min进行羊膜上皮细胞的消化；

⑷取出培养皿，将羊膜-硝酸纤维素膜复合体从培养皿中取出，浸泡在PBS缓冲液中清洗3次，以洗净消化液；

⑸将洗净后的羊膜-硝酸纤维素膜复合体平铺在培养皿中，一手持镊子捏住羊膜-硝酸纤维素膜，一手持细胞刮刀，按同一个方向轻轻刮去羊膜上皮细胞，同时转动羊膜-硝酸纤维素膜，彻底刮除羊膜上皮细胞；

⑹将刮除羊膜上皮细胞的羊膜-硝酸纤维素膜复合体用PBS缓冲液清洗羊膜上皮面3次，以彻底清除残留的上皮细胞。

4.根据权利要求1所述的简单高效的干细胞贴片制备方法，其特征在于：所述羊膜上皮细胞消化后的鉴定的具体步骤如下：

⑴用无菌眼科剪剪取羊膜-硝酸纤维素膜复合体的一角，去除硝酸纤维素膜，将羊膜直接平铺于盖玻片上，使羊膜上皮面朝上，且羊膜完全展开，置于培养皿中；

⑵在羊膜上皮面上滴加苏木精，使苏木精完全覆盖羊膜上皮面，室温浸染5分钟后，向培养皿中加入自来水清洗苏木精，反复清洗3次，清洗完成后吸尽培养皿中的自来水；

⑶在羊膜上皮面上滴加分化液进行分化，使之完全覆盖羊膜上皮面，分化15秒；向培养皿中加入自来水，使整张盖玻片完全浸泡在自来水中，浸泡15分钟；用移液管吸尽自来水，将伊红滴加至羊膜上皮面上，浸染2分钟；

⑷向培养皿中加入自来水，清洗羊膜上皮面，镜下观察着色情况，观察镜下是否还能观察到清晰完整的羊膜上皮细胞；镜下观察不到清晰完整上皮细胞的羊膜可用于羊膜爬片的制备。

5.根据权利要求1所述的简单高效的干细胞贴片制备方法，其特征在于：所述制备干细胞贴片的步骤如下：

⑴用眼用镊子小心的将去上皮细胞羊膜一端掀起，并将无菌石英片缓缓插入到羊膜下表面，待石英片完全深入到羊膜下方后，用镊子轻轻将羊膜包裹在石英片的四周，并使石英片表面上的羊膜完全伸展；

⑵将羊膜爬片置于6cm无菌培养皿中，放入CO2培养箱中干燥60min，使羊膜爬片与孔底结合牢固；

⑶取1mL细胞悬液，缓慢加入到装有羊膜爬片的6cm无菌平皿中；

⑷再添加4mL含10％FBS的DF-12培养基，轻轻摇匀，不能使羊膜爬片飘起，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育培养；

⑸24h后观察培养基颜色的变化及细胞贴壁情况；

⑸48h后将培养皿取出，用微量移液枪吸去孔中的培养基，向培养皿中加入3mLPBS，重复冲洗3次；

⑺吸尽PBS，加入5mL新鲜的含10％FBS的DF-12培养基继续培养；

⑻羊膜负载的脐带MSC约需培养5-7d，每两天换一次液；

⑼待脐带MSC在羊膜上皮面生长至90％融合时，可用于糖尿病足的临床治疗。