[发明专利]重组载体、含有其的工程菌及在产α-酮戊二酸的应用

说明书

本发明提供一种重组载体，含有L‑谷氨酸氧化酶的编码基因和过氧化氢酶的编码基因。本发明还提供了一种产α‑酮戊二酸的基因工程菌，包含宿主菌及导入所述宿主菌的含有目的基因的重组载体，所述目的基因为L‑谷氨酸氧化酶的编码基因和过氧化氢酶的编码基因。另提供了所述基因工程菌的制备方法及应用。含有本发明重组载体的工程菌可以高效地转化合成α‑酮戊二酸。本发明的生产方法所用原料相对低廉，工艺简单，生产效率高，易于工业化大规模生产。

技术领域

本发明总地涉及基因工程领域，更具体地涉及重组载体、含有其的工程菌及在产α-酮戊二酸的应用。

背景技术

α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，α-KG)作为一种重要的短链羧酸分子，是三羧酸循环中重要的代谢中间产物。它具有广泛的应用前景，可以被广泛应用于医学领域，减轻肾病患者的肾脏负担、减少并发症和促进患者手术后快速恢复；也可以应用于食品保健，α-酮戊二酸与精氨酸等氨基酸复配，能快速帮助运动员补充能量。除此以外，由于α-酮戊二酸特殊的化学性质，被广泛用于化学合成行业。

α-酮戊二酸目前的合成方法主要有：化学合成法，微生物发酵法，酶法。

化学合成法生产α-酮戊二酸，虽然具有收率高、原料易得的特点，但反应过程中大量有机溶剂的使用，以及多步复杂的合成反应过程中会产生大量副产物从而增加分离成本，使得化学合成法总成本偏高、对环境不友好。因此近年来采用生物法来生产α-酮戊二酸的报道越来越多。

微生物发酵法生产α-酮戊二酸，相对于化学法，具有环境友好等特点，是研究报道的热点。1968年，Finogenova等利用液体石蜡生产微生物蛋白时发现解脂亚洛酵母Yarrowia lipolytica能够积累α-KG。1969年，Tanaka等发现石蜡节杆菌Arthrobacterparaffineus能利用石蜡积累高达70g/L的α-KG。江南大学的陈坚等人利用重组菌发酵生产α-酮戊二酸，发酵时长48-72h，α-酮戊二酸产量达到18.6g/L(发明专利公开号CN101245323A)；另一篇专利中经过工艺和菌种的改进，α-酮戊二酸产量达到31.7g/L(发明专利公开号CN101717735A)；经过进一步改进的方案，α-酮戊二酸产量达到47.2g/L，发酵时长144h(发明专利公开号CN102586128A)。天津科技大学的陈宁等人利用谷氨酸棒杆菌发酵生产α-酮戊二酸，发酵32h，α-酮戊二酸产量最高可达47.2g/L(发明专利公开号CN102391977A)。可以看出，生物发酵也有其缺点：生产周期长，产量低，产品与发酵液中多种成分混合在一起，导致提取与精制工艺复杂，总成本偏高。

酶合成法，目前合成α-酮戊二酸的酶主要有L-谷氨酸脱氢酶(GDH)、L-氨基酸氧化酶(LAAO)和L-谷氨酸氧化酶(LGOX)。以上3种酶都是利用L-谷氨酸盐为底物，生成α-酮戊二酸，其中，L-氨基酸氧化酶对底物的专一性不强，产物α-酮戊二酸会抑制L-氨基酸氧化酶的活性；L-谷氨酸脱氢酶需要外源性添加NAD⁺或NADP⁺，而且L-谷氨酸脱氢酶更倾向于分解α-酮戊二酸；相比之下，L-谷氨酸氧化酶对底物专一性强，无需添加辅因子，仅产生NH₃与H₂O₂，而且L-谷氨酸氧化酶在确定温度和pH下能长时间保持活性，是目前为止最高效的合成方法。目前酶法转化生成α-酮戊二酸最高产量为：2014年Panqing Niu等利用重组L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶24h催化110g/L谷氨酸盐生成104g/Lα-酮戊二酸。但是转化时间较长，工艺相对复杂，需要纯化酶，或者固定化酶等，会增加α-酮戊二酸的生产成本。因此迫切需要构建高效率、安全、工艺简单、低成本的α-酮戊二酸基因工程菌株，以满足工业化生产α-酮戊二酸的需求。