[发明专利]基于sanger测序人线粒体基因组的方法

说明书

本发明公开了一种基于sanger测序人线粒体基因组的方法，所述方法包括如下步骤：人总DNA提取；根据NCBI数据库中已测出的人线粒体序设计覆盖线粒体全长的引物对，对人总DNA进行PCR扩增；回收PCR扩增产物，获得人线粒体特定的基因片段；对所述基因片段进行测序；用CExpress对测得的序列根据引物对与引物对之间的序列重叠区进行拼接，组装得到人线粒体全序列。本发明只需提取人总DNA，避免了提取较高纯度mtDNA繁琐的实验操作过程，然后根据NCBI数据库中已测出的人线粒体序列设计覆盖线粒体全长的引物对，对总DNA进行扩增，得到线粒体特定的基因片段，进行测序，减少了对于总DNA测序的数据量。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种基于sanger测序人线粒体基因组的方法。

背景技术

线粒体自发现以来，其形态结构，基因组成，复制，转录与翻译，与核基因组的关系，以及其遗传特点，进化特点和分子系统学方面都积累了大量的资料。线粒体是真核细胞内重要的细胞器，能量生成的场所，还参与脂肪酸的合成及某些蛋白质的合成。线粒体DNA是细胞内相对独立的基因组。线粒体DNA是细胞内较小而又较易纯化的复制转录单位，基因组结构比较简单，并具有很高的专一性，独特性，它的传递、重组、分离、复制、转录都可应用分子生物学的许多手段和方法进行分析。因此，线粒体DNA不仅是研究DNA结构与DNA复制、转录的良好模型，也是研究真核细胞核酸与蛋白质合成等一般问题非合适的模型系统。从Anderson等(1981)测定人线粒体基因组的全序列以来，人线粒体是一条共价闭合的双链DNA，分子量较小，长度为16569个碱基。人线粒体基因组共含有37个基因。22个tRNA基因，细胞色素b基因(Cytb)、细胞色素氧化酶3个亚基基因(COI，COII，COIII)，NADH氧化还原酶7个亚基基因(ND1，ND2，ND3，ND4，ND4L，ND5，ND6)和ATP酶2个亚基基因(ATPase6，ATPase8)，一个12S rRNA基因，一个16S rRNA基因。

线粒体DNA的突变与许多人类疾病相关，由线粒体DNA突变引起的一类疾病被称为线粒体疾病。从分子生物学的角度研究线粒体疾病可以揭示疾病的发生、发展及其遗传规律，从而为疾病的诊断、治疗及预防提供科学依据。目前研究发现的线粒体疾病主要有Lerber’s遗传性视神经病、线粒体脑肌病、母系遗传的糖尿病和耳聋等。

现有多种线粒体基因测序方法，如基于克隆文库的sanger测序法，基于PCR预扩增或者提取mtDNA的高通量测序法、基于总DNA的高通量测序法等，这些测序方法关键是在于获得较高纯度的mtDNA，或是需要测序的原始数据量较高。但是获得较高纯度的mtDNA，操作比较繁琐，实验过程稍有不慎，得到的mtDNA会有核DNA污染，大量的原始数据量会大幅度增加测序的工作量。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种基于sanger测序人线粒体基因组的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种基于sanger测序人线粒体基因组的方法，所述方法包括如下步骤：

S1、人总DNA提取；

S2、根据NCBI数据库中已测出的人线粒体序设计覆盖线粒体全长的引物对，对人总DNA进行PCR扩增；

S3、回收PCR扩增产物，获得人线粒体特定的基因片段；

S4、对所述基因片段进行测序；用CExpress对测得的序列根据引物对与引物对之间的序列重叠区进行拼接，组装得到人线粒体全序列。