[发明专利]一种海蛇抗菌肽改造体及其原核表达制备方法和用途

说明书

本发明公开了一种青环海蛇(Hydrophis cyanocinctus)抗菌肽Hc‑C改造体及其原核表达制备方法和用途。本发明所述的青海海蛇抗菌肽Hc‑C改造体为原始抗菌肽QHA前17个氨基酸组成，保留了母本活性基团，具有广谱的抗菌活性，其基因经过优化后能在大肠杆菌BL21中以融合蛋白的形式高效表达，利用甲酸切割释放Hc‑C保留了原始抗菌活性，且具有好的热稳定性和酸稳定性。在制备抗菌药物中，Hc‑C是一种优良的不易产生耐药性的抗菌药物，具有很高的经济价值和巨大的社会效益。

技术领域：

本发明属于生物技术制药工业中基因工程领域，具体是一种海蛇抗菌肽改造体Hc-C原核表达及其应用。

背景技术：

近年来传统抗生素的大规模滥用导致越来越严重的病原微生物耐药问题，给人类健康带来巨大的威胁。临床上应对耐药微生物感染的措施是使用对耐药微生物尚未使用过的新的或者替代性的抗生素，因此这就需要持续开发新的抗微生物药物。

抗菌肽是生物体基因编码的一种天然小分子多肽，是生物体免疫系统的一种重要分子，对细菌、真菌、病毒甚至原虫均具有直接的杀灭作用。抗菌肽具有分子量小、结构简单、抗菌活性强、杀菌机制独特、毒性低和不易引起耐药性等优点，因此自发现之日起就被认为是具有极大开发潜力的新一代抗生素。到目前为止，已从不同生物体中发现超过1500多种不同的抗菌肽，而且其数目还在增加。改造体抗菌肽的应用，所述改造体抗菌肽用于制备抗菌药物、防感染药物、防腐剂、动物饲料或化妆品前体的用途。

抗菌肽药物原料药获得方式主要有化学合成和基因工程表达，但化学合成的生产管理和质量控制要求高，且生产中引入杂质多具有环境不友好性等缺点，而基因工程天然发酵表达方式成本低，相对引入毒性物质少更易被人们接受。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种海蛇抗菌肽改造体及其原核表达载体构建方法及表达产物与制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种改造体抗菌肽，改造体抗菌肽为青环海蛇(Hydrophis cyanocinctus)抗菌肽QHA改造体Hc-C，其是直链多肽，含有17个氨基酸残基，分子量2151.7Da，等电点12.32。

所述改造体抗菌肽为：Lys¹Phe²Phe³Lys⁴Arg⁵Leu⁶Leu⁷Lys⁸Ser⁹Val¹⁰Arg¹¹Arg¹²Ala¹³Val¹⁴Lys¹⁵Lys¹⁶Phe¹⁷。

所述改造体抗菌肽基因序列为：5’-aaatttttcaaaaggctgctgaagagcgtgaggcgtgcagtcaagaaattc-3’

所述改造体抗菌肽基因优化后序列为：5’-aaattcttcaaacgtctgctgaaatccgtgcgtcgtgcggttaagaaattt-3’。

一种海蛇抗菌肽改造体Hc-C制备方法如下：

1)扩增带有酶切位点、甲酸识别位点及终止密码子Hc-C基因序列并构建重组载体pET-32a-Hc-C；

2)重组载体转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)工程菌中并进行诱导表达及培养条件优化；

3)融合蛋白经过HisTrapTM FF镍柱亲和层析纯化除盐冻干备用；

4)甲酸切割释放Hc-C后再次镍柱亲和层析收集不挂柱蛋白，除盐冻干后与标准品进行液相图谱比对。