[发明专利]一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法

说明书

技术领域

本发明属生物制药领域，涉及血液制品的制备，具体讲是涉及一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法。

背景技术

人凝血因子Ⅶ（FVII）与人凝血因子IX（FIX）均是肝脏合成的维生素K依赖的凝血因子，前者由406个氨基酸残基组成，分子量约50KD,等电点4.9,血浆中浓度为0.5-2mg/L,后者由416个氨基酸残基所组成，分子量约57KD，血浆中浓度为5mg/L左右。两种凝血因子在凝血过程中均发挥着非常重要的作用。其中FVII是机体外源凝血途径的始动因子，无论是原发性的还是继发性的FⅦ缺乏，都有可能造成出血，甚至危及生命，故对于FⅦ缺乏的患者，输注浓缩的纯化FⅦ,可以纠正其出血倾向，恢复正常的凝血机能。

近年来，重组活化人凝血VIIa对血小板减少症和血小板功能障碍、严重创伤、大面积外科手术的血具有令人满意的治疗效果，也成为带有凝血因子Ⅷ或Ⅸ抑制物的先天性A型或B型血友病人的替代疗法。可见人凝血因子VII的临床需求是十分巨大的。而人体因缺乏凝血FIX则会导致凝血障碍即为乙型血友病，该病是一种遗传性疾病，以自发性或创伤相关的出血为特征，出血部位主要在关节、软组织和肌肉。治疗的延迟或不足会引起各种并发症，包括关节反复出血相关的关节病和滑膜炎，严重时可导致关节畸形和功能障碍。另外，更严重的出血，尤其是颅内出血可能导致死亡。目前治疗乙型血友病唯一有效的方法就是及时注射含凝血FIX的药物以达到止血的目的，或者定期注射含凝血FIX的药物预防出血。含凝血FIX的药物有血浆提取的高纯人凝血FIX、人凝血酶原复合物（PCC）以及基因重组人凝血FIX(辉瑞公司生产的“贝赋”)等，国内目前只有冻干人凝血酶原复合物（PCC）品种。临床实践表明，乙型血友病人注射高纯人凝血FIX很安全，而注射人凝血酶原复合物却可能产生严重的副作用―血栓症，所以高纯人凝血FIX是治疗乙型血友病的首选药物，但传统的高纯人凝血FIX生产工艺，工序复杂，在制备FIX过程中，将宝贵的FVII当作杂质去除，且在生产过程中易出现凝血酶激活的问题而致产品失败，再加上传统工艺的病毒灭活手段单一，不能完全保证制品的安全，而干热病毒灭活方式往往导致较大的活力损失。

针对这一现状，本发明开发了一种从去冷胶血浆中同时制备高纯FVII及FIX的方法，本发明采用离子交换层析结合亲和层析技术及PEG沉淀去杂，实现了纯化、精制FVII及FIX的目标，流程简单，生产周期短，FVII与FIX的收率均超过50%。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺稳定、产品质量好、得率高、成本低及生产效率高的能同时制备人凝血因子IX及VII的方法。

1．一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）去冷胶血浆的制取

将新鲜冰冻血浆融化，在0-3℃下连续离心，去除冷胶，上清即为去冷胶血浆，后用颇尔公司生产的Supradur50P滤板串联0.45μm滤芯过滤，得到澄清的去冷胶血浆；过滤前,用缓冲液预洗滤芯；缓冲液由柠檬酸钠、氯化钠及水组成，其中柠檬酸钠浓度为0.01M-0.02M，氯化钠浓度为0.075M-0.15M氯化钠，缓冲液PH值为6.50-7.50，温度10-15℃；

（2）第一次强阴离子交换柱层析

步骤（1）得到的澄清去冷胶血浆上强阴离子交换柱，柱子预先用平衡缓冲液1平衡;上柱过程中收集穿透液于带低温冷媒夹套的坦克中，用于后续血制品的加工生产；上柱结束后，用平衡缓冲液1冲洗柱子，然后用洗脱缓冲液1洗脱柱子，收集洗脱液，即为富含FVII与FIX的溶液；

（3）PEG沉淀去杂蛋白

在步骤（2）收集的洗脱液中加入50%PEG溶液使最终PEG浓度至3-6%,搅拌0.5-1.5小时，后用1.0μm滤芯过滤，收集澄清的滤液；

（4）S/D病毒灭活

在步骤（3）收集的滤液中加入Tween80至1.0%（wt%）,TNBP（磷酸三丁酯）至0.3%（wt%），搅匀后升温至24-26℃，后保温6-7小时；

（5）第二次强阴离子柱层析

将上述S/D后的溶液用稀释液稀释到电导率小于15ms/cm(25℃)，然后上强阴离子柱，柱子预先用平衡缓冲液2平衡;上柱结束后，用平衡缓冲液2冲洗柱子，然后用洗脱缓冲液2A洗脱柱子，所得洗脱液A即为凝血FVII粗品；再用洗脱缓冲液2B洗脱，收集洗脱液B即为凝血FIX粗品；

（6）弱阴离子柱层析纯化凝血FVII