[发明专利]一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法

权利要求书

1.一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）去冷胶血浆的制取

将新鲜冰冻血浆融化，在0-3℃下连续离心，去除冷胶，上清即为去冷胶血浆，后用颇尔公司生产的Supradur50P滤板串联0.45μm滤芯过滤，得到澄清的去冷胶血浆；过滤前,用缓冲液预洗滤芯；缓冲液由柠檬酸钠、氯化钠及水组成，其中柠檬酸钠浓度为0.01M-0.02M，氯化钠浓度为0.075M-0.15M氯化钠，缓冲液PH值为6.50-7.50，温度10-15℃；

（2）第一次强阴离子交换柱层析

步骤（1）得到的澄清去冷胶血浆上强阴离子交换柱，柱子预先用平衡缓冲液1平衡;上柱过程中收集穿透液于带低温冷媒夹套的坦克中，用于后续血制品的加工生产；上柱结束后，用平衡缓冲液1冲洗柱子，然后用洗脱缓冲液1洗脱柱子，收集洗脱液，即为富含FVII与FIX的溶液；

（3）PEG沉淀去杂蛋白

在步骤（2）收集的洗脱液中加入50%PEG溶液使最终PEG浓度至3-6%,搅拌0.5-1.5小时，后用1.0μm滤芯过滤，收集澄清的滤液；

（4）S/D病毒灭活

在步骤（3）收集的滤液中加入Tween80至1.0%（wt%）,TNBP（磷酸三丁酯）至0.3%（wt%），搅匀后升温至24-26℃，后保温6-7小时；

（5）第二次强阴离子柱层析

将上述S/D后的溶液用稀释液稀释到电导率小于15ms/cm(25℃)，然后上强阴离子柱，柱子预先用平衡缓冲液2平衡;上柱结束后，用平衡缓冲液2冲洗柱子，然后用洗脱缓冲液2A洗脱柱子，所得洗脱液A即为凝血FVII粗品；再用洗脱缓冲液2B洗脱，收集洗脱液B即为凝血FIX粗品；

（6）弱阴离子柱层析纯化凝血FVII

将上述洗脱液A用稀释液稀释到原来的2-4倍，然后上弱阴离子柱，柱子预先用平衡缓冲液3平衡；上柱结束后，用以上平衡缓冲液3冲洗柱子，然后用洗脱缓冲液3洗脱柱子，所得洗脱液即为精制的凝血FVII溶液；用0.45μm滤芯过滤得到澄清滤液；

（7）肝素亲和柱层析纯化凝血FIX

将以上洗脱液B用稀释液稀释到电导率小于15ms/cm(25℃)，上肝素亲和柱，柱子预先用平衡缓冲液4平衡，后用洗涤缓冲液4洗涤，再用洗脱缓冲液4洗脱，收集洗脱液，用0.45μm滤芯过滤,所得滤液即为精制的凝血FIX溶液；

（8）超滤

用5K~10k截留分子量的超滤膜包分别浓缩以上FVII及FIX滤液，并用透析液分别恒体积透析4-6倍，后浓缩至所需活力效价后移出超滤膜包；

（9）加稳定剂及调节

按照所需规格分别调节人凝血FVII的效价及FIX的效价至所需值（一般为20-30IU/ml），后分别加入稳定剂并分别调PH值至6.50-7.50；

（10）纳米膜除病毒过滤

分别用15-20纳米滤芯对以上FVII及FIX溶液进行除病毒过滤；

（11）除菌过滤并分装

分别用0.22μm滤芯对以上FVII及FIX溶液进行

（12）冻干

分别冻干以上凝血FVII及FIX原液，得到凝血FVII及FIX冻干粉；

（13）干热除病毒过滤

分别或同时将FVII及FIX冻干品在100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活。

2.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，其特征在于：步骤（2）所述的强阴离子交换柱层析所用填料为CaptoQ，QSepharoseFF,QSepharose4FFQSepharoseHP,QSepharoseXL中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的一种从去冷胶血浆中同时制备人凝血因子IX及VII的方法，其特征在于：步骤（2）所述的柱层析所用的平衡缓冲液1组成为0.01M-0.02M柠檬酸钠，0.075M-0.15M氯化钠，PH6.50-7.50；所述的洗脱缓冲液1组成为0.01M-0.02M柠檬酸钠，0.4M-0.8M氯化钠，0.02-0.04M盐酸精氨酸，PH6.50-7.50。