[发明专利]一种秦岭非法贸易动物物种分子鉴定的方法及其引物

说明书

技术领域

本发明属于物种鉴定分子技术领域，具体涉及一种秦岭非法贸易动物物种分子鉴定的方法及其引物。

背景技术

陕西省自然条件复杂，作为我国南北气候分界线的秦岭山脉，既是动物地理分布区系东洋界和古北界的分界线，也是我国南北方动物的汇聚地及第四纪动物的天然庇护所。复杂多样的自然环境孕育了陕西省动物资源的多样性，尤其是动物特有种和珍稀种分布较多，使这里成为大熊猫、金丝猴、朱鹮、羚牛等珍稀动物的故乡。陕西省目前共有脊椎动物604种，其中国家级重点保护动物80余种，主要包含的兽类有大熊猫、华南虎、金丝猴、羚牛、云豹、林麝等20余种。由于高额利润的诱惑以及经济的发展,野生动物作为被害对象的各种违法犯罪活动屡禁不止，且人们涉及的动物不合法经济活动也越来越多，尤其以黑熊、羚牛、斑羚、鬣羚、小麂、林麝等濒危野生动物为主。为了有效阻止非法经营和走私野生保护动物的违法行为，并为执法部门提供合理准确的证据，就需要对野生保护动物进行物证鉴定。但是由于现阶段的物种鉴定，多是从外观上的鉴定，有一定的局限性。如，动物体外形遭到破坏，不能鉴定到种；走私物品是野生动物的肌肉、骨骼或者毛皮，不能直接从外观鉴定；有些动物处于幼体状态，不能分辨出种类等。因此，找出一个不依赖于外观的物种鉴定方法，对于野生动物保护和打击非法经营和走私野生动物活动有着重要的意义。

目前对于动物物种分子鉴定采用的是一个物种一个引物的常规方法，但是实践证明对未知样本用常规引物往往是不可行的。因为每一种引物的反应条件、反应时间、退火温度都不一样。在进行物种鉴定时，浪费大量的时间和实验材料，在有些刑事案件中，还会影响案件侦破的速度。因此现有技术存在的问题是：针对秦岭非法贸易动物物种鉴定时缺少一个共同引物，鉴定时间长，浪费资源，不适用于进行分子物种鉴定。

发明内容

本发明的目的是提供一种秦岭非法贸易动物物种分子鉴定的方法及其引物，克服现有技术存在的针对秦岭非法贸易动物物种鉴定时缺少一个共同引物，鉴定时间长，浪费资源，不适用于进行分子物种鉴定的问题。

本发明所采用的技术方案是：

一种秦岭非法贸易动物物种分子鉴定的引物，其特征在于：

该引物用于秦岭非法贸易动物羚牛、林麝、斑羚、鬣羚、毛冠鹿、小麂、黑熊、果子狸、豹猫、野猪、大熊猫、金丝猴、黄鼬、鼬獾和獾共15种动物的物种分子鉴定，其核苷酸序列为：

L：5’-AACCATCATTAATGTCGTCT-3’

H：5’-GGGAGAATATAGTAGGTAGTC-3’。

一种秦岭非法贸易动物物种分子鉴定的方法，其特征在于：

提取样品DNA后，利用权利要求1涉及的引物进行PCR扩增，对PCR产物进行测序，与15种秦岭非法贸易动物已经测得的序列进行对比，聚类分析关系最近的即为该种动物。

所述DNA提取由以下步骤实现：

剪取待检样品肌肉黄豆大小或者带毛囊的毛发3-5根或者皮张5cm²大小或者骨髓组织黄豆大小，置于1.5mL离心管中，分别用90%酒精、70%酒精、纯水清洗数次；

加入200μL悬浮好的5%Chelex-100，2ul10mg/mL蛋白酶K，混匀，56℃水浴保温两小时以上；

水浴取出后，震荡，100℃保持8分钟，震荡5-10秒；13000转离心2-3分钟，4℃冰箱保存待扩增。

所述PCR扩增由以下步骤实现：

将提取到的DNA进行PCR扩增，扩增引物序列为：

L：5’-AACCATCATTAATGTCGTCT-3’

H：5’-GGGAGAATATAGTAGGTAGTC-3’；

PCR反应体系为：

PCR反应总体积为50μL，其中10×PCRBuffer5.0μL，dNTP(200μmol/L)1.0μL，DNA模板2μL，上下游引物(0.2μmol)各2μL，Taq酶(5U/μL)0.4μL，超纯灭菌水37.6μL；

PCR扩增程序：

95℃预变性60秒，94℃变性60秒，52℃退火60秒，72℃延伸3.5分钟，共运行35个循环，最后一个循环后于72℃保温10分钟，4℃保存备用；

所述测序与对比由以下步骤实现：

将PCR产物进行测序，用Clustal软件将测序结果和15种动物已经测得的序列进行对比，聚类分析关系最近的即为该种动物；

15种动物已经测得的序列为：

羚牛：