[发明专利]一组用于中华绒螯蟹微孢子虫检测的PCR引物及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于病原微生物分子检测技术领域，具体涉及一组用于中华绒螯蟹微孢子虫检测的PCR引物及其试剂盒。

背景技术

中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)俗称河蟹，是一种珍贵的淡水养殖品种，在农业经济中扮演着非常重要的角色，但随着养殖集约化和规模化发展，近些年各类疾病频发，严重限制了该产业的健康稳定发展。2014年以来，在江苏省兴化市、盐城市盐都区和泗洪县等地的河蟹主养区广泛流行微孢子病，该疫情给当地的河蟹养殖产业造成了巨大损失。主要症状为河蟹附肢长期空瘪，虽能继续蜕壳，但生长缓慢，解剖见肝胰脏颜色由金黄色逐渐变浅，直至灰白色，部分还出现“拉黄”(排泄肝胰腺)的症状。迄今为止，该病的诊断仍然是采用解剖观察的方法，具有明显的局限性，因此开发出更加高效、准确和便捷的分子诊断方法将有非常显著的现实意义和广阔的应用前景。

聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是生物学领域中的一项具有里程碑式的发明，该方法能在一个试管内将目的基因或某一DNA片段于很短的时间内扩增十万甚至百万倍，具有敏感性高、特异性好、快速方便等特点，广泛应用于分子诊断领域。但由于中华绒螯蟹中的微孢子虫感染是最近刚发现，因此目前还未见将PCR这一很有前景、高效的检测方法应用于中华绒螯蟹微孢子虫检测的报道，本发明有望填补此项空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一组根据中华绒螯蟹微孢子虫18SSSUrDNA(HE584635)基因序列设计的特异性PCR引物，并提供PCR检测试剂盒，实现中华绒螯蟹微孢子虫的早期、快速、便捷地检测，为生产中的疫情防控提供依据。

所述的一组特异性引物如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，扩增的目的基因序列如SEQIDNO.3所示。

本发明还公开了上述中华绒螯蟹微孢子虫的特异性引物在制备中华绒螯蟹微孢子虫PCR检测试剂盒中的应用。

本发明还提供包含上述引物的用于检测中华绒螯蟹微孢子虫病的PCR试剂盒。所述试剂盒包括上述特异性引物(Q2F/Q2R)，dNTPs、EXTaqDNA聚合酶(Takara)、PCR反应缓冲液(EX10×Buffer,Takara)、标准阳性模板。

本发明具有如下有益效果：

(1)可以大批量快速鉴定中华绒螯蟹感染微孢子虫情况；

(2)由于PCR方法的高灵敏性，所需样本量大大减少，检测成本和工作量也大大降低；

(3)在高效、准确检测微孢子虫的同时可根据条带亮度分析感染率和感染强度。

附图说明

图1中华绒螯蟹微孢子虫的PCR检测结果图，其中M，DNAmarker；P，阳性对照；N，阴性对照；1-8，样本检测结果(2为阴性结果，其余均为阳性结果)。

具体实施方式

下列实验及操作实例是进一步对本发明的说明，不应该当作对本发明的限制。以下实施例中除特别说明外，均为本领域内的常规试剂、实验方法和操作步骤。

实施例1

中华绒螯蟹样品

送检的中华绒螯蟹样品于2015年9月取自江苏省内一处曾暴发微孢子虫疫情的中华绒螯蟹养殖池塘，平均重量91.2g。健康中华绒螯蟹取自另一处南京市中华绒螯蟹养殖场，平均重量94.3g。健康中华绒螯蟹通过光镜、电镜观察和原位杂交检测，确定无微孢子虫感染，作为阴性对照；阳性对照样品为本实验之前收集，经光镜、电镜观察和原位杂交检测确定存在微孢子虫感染。

模板DNA的提取

DNA提取采用苯酚-氯仿法，具体为：加1ml基因组抽提液(0.1mol/lEDTA，10mmol/lTris-HCl，20ug/ml胰RNA酶，0.5％SDS)，匀浆后，55℃放置30min，以便样本被充分裂解；每1ml基因组抽提液样本加入200μl氯仿(三氯甲烷)；盖严管盖，上下剧烈摇晃15秒后，室温放置3min；在4℃下12000g离心15min；离心后，管中液体将分层，转移最上层的无色液体(约总体积50％左右)至一个新的Eppendorf管中；向新的上层液体中加500μl100％异丙醇，室温放置10min，在4℃下12000g离心10min；小心吸去上清，加入75％乙醇，上下颠倒八次，7500g，4℃离心5min；除去乙醇后，开盖室温放置5-10min，即得到纯化的DNA；DEPC水溶解后琼脂糖电泳检测。