[发明专利]大熊猫抗细菌潜力检测的II类MHC基因的特异性引物及分型方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于扩增大熊猫II类主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)基因二号外显子的特异性引物和II类MHC基因的分型方法，尤其涉及大熊猫抗细菌潜力检测的II类MHC基因的特异性引物及分型方法。

背景技术

大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)是我国特有的珍稀物种，为国家一级保护动物，也是世界自然基金会的形象大使和世界生物多样性保护的旗舰物种。另外，如今的大熊猫虽以竹子为主食但其牙齿和消化道却保留食肉动物的特征，因此其演化和生存的过程也备受关注。被誉为“国宝”的大熊猫在距今60万年前曾广泛分布于我国东南黄河、长江和珠江流域，然而现代农林业的发展使其生境破碎片断化，迫使它们彼此孤立在秦岭、岷山、邛崃山、凉山、大相岭和小相岭六个山系中。

多项保护遗传学研究采用分子技术利用中性标记(如线粒体DNA控制区、指纹图谱和微卫星标记等)发现彼此隔离的山系减少甚至阻断了大熊猫种群间的基因交流，使得该物种遗传多样性降低且种群分化加剧。这些研究虽然为解决种群的历史和结构等问题提供了帮助，但并未反映出大熊猫在种群演化过程中的适应性能力。另外，如今大熊猫的生存严重受到高疾病感染率和高死亡率的威胁。因此，为了进一步了解大熊猫的适应性能力和其高染病率的成因，就需要深入研究与大熊猫疾病抗性有关的基因，如编码与免疫相关的主要组织相容性复合体(MHC)的MHC基因家族，这是因为MHC分子具有结合及呈递抗原从而激发相应免疫反应的功能，所以其在面对多变的病原时展现的适应性进化可以作为评估一个物种适应性能力的标记。

II类MHC基因编码丰富的细胞表面蛋白，这些蛋白只存在于吞噬性细胞表面。当吞噬性细胞吞食掉侵入组织的细菌后，细菌碎片将通过II类MHC提示给辅助T细胞，启动专一性免疫反应。因为II类MHC分子具有细菌病原识别和呈递功能，所以II类MHC基因的基因型、表达多样性及表达丰度影响着机体对疾病的易感性和自身免疫能力等多种生物学特征。而经典II类MHC结合细菌病原肽的部位由基因二号外显子编码，因此研究经典II类MHC基因二号外显子的多态性和基因型有助于我们探究大熊猫II类MHC基因中与疾病有关的特定等位基因和该物种抗细菌感染能力强弱。然而，由于MHC基因是多基因家族，基因复制和协同进化使同一座位上的不同等位基因差异较大，而不同座位之间的等位基因又高度相似，因此在用通用引物进行多位点扩增时，前者可能造成同一座位上等位基因扩增失效和无效等位基因的产生，而后者则造成不同座位等位基因的交叉扩增。另外，假基因的存在也会影响研究结果。因此，在分离和鉴定大熊猫所有表达的II类MHC基因的基础上设计座位特异引物并进行正确大熊猫II类MHC基因分型和基因多态性分析，是研究与细菌引起的疾病有关的特定等位基因和评估大熊猫抗病能力的必要前提，对全面和科学地进行大熊猫保育有重要借鉴意义，比如野外放归时选择适应能力强的个体和选择优良个体进行人工配种。

发明内容

本发明目的是克服现有技术的不足，提供大熊猫II类MHC区域6个经典座位(1个DRA，1个DRB3，2个DQA及2个DQB)二号外显子扩增的特异性引物和基因分型方法，它能满足现有技术的上述需求。

用于扩增大熊猫II类MHC区域DRA、DRB3、DQA1、DQA2、DQB1和DQB2基因二号外显子的特异性引物组包括十对引物，引物对的核苷酸序列如下所示：

引物对一：上游引物DRAF：GTCTCACATCCCGGGTTCTTCTT(如SEQIDNO:1所示)；

下游引物DRAdn：TTTCAAAGTTAGGATTCCCGTGTCT(如SEQIDNO:2所示)；

引物对二：上游引物RAF:TTCCTCTCCCCCTCCTGGTTCC(如SEQIDNO:3所示)；

下游引物RAR:TAGGATTCCCGTGTCTAGGAGTGC(如SEQIDNO:4所示)；

引物对三：上游引物DRB1F2：GAGCCCGCGGGTGAGCGGATC(如SEQIDNO:5所示)；

下游引物RB13dn4：CCACACAGTCCCTGACGTCT(如SEQIDNO:6所示)；

引物对四：上游引物DRB1F3:AGCGGATCGTCTCTGTCCCCA(如SEQIDNO:7所示)；

下游引物RB13dn3:CCCTGTATGTTCACTCCGGATGT(如SEQIDNO:8所示)；