[发明专利]检测转基因玉米T4-1-1外源基因纯合/杂合状态的方法及试剂盒

说明书

技术领域：

本发明涉及一种对转基因玉米T4-1-1外源基因插入的纯合/杂合状态的检测方法，本发明还涉及针对上述检测所用的试剂盒。

背景技术

转基因作物的检测中，不仅需要知道样品中是否含有转基因成分，含有何种转基因成分，有时还需要确认外源DNA插入的纯合或杂合状态。这种转基因成分的定性检测亦称为筛选检测。

转基因成分检测中，可以将外源DNA看作一个基因座位。纯合体的2倍体基因组中检测靶标核酸序列，即外源DNA插入特征序列的拷贝数为2；杂合体的2倍体基因组中外源DNA插入特征序列的拷贝数为1；非转基因材料中则为0。因此，转基因检测过程中，必需对原材料中靶标核酸序列的遗传特性进行确认，即确认外源DNA插入所产生的特征序列是纯合还是杂合状态。此外，在转基因作物遗传育种过程中，往往需要将转基因材料与其它材料进行杂交、转育以获得适合的栽培品种，利用分子生物学手段快速、简便鉴定纯合体/杂合体育种材料，也有利于缩短育种进程。

迄今未止，国内外还没有针对转基因玉米T4-1-1外源基因纯合/杂合状态的检测方法，只能确定转基因玉米T4-1-1样品中是否含有转基因成分或含有何种转基因成分。

因此，找到能直接鉴别玉米T4-1-1样品中外源DNA插入的纯合或杂合状态的方法并开发相应的检测试剂，很有必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种针对转基因玉米T4-1-1外源基因插入的纯合/杂合状态的检测方法，并开发针对上述检测所用的试剂盒。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明首先设计了一种用于检测转基因玉米T4-1-1外源基因插入的纯合/杂合状态的PCR检测引物。根据转基因玉米T4-1-1外源插入片段旁侧序列信息，在玉米染色体部分设计出一对能够准确检测转基因玉米T4-1-1外源基因插入的纯合/杂合状态的PCR检测引物，其核苷酸序列分别为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。

本发明提供了一种针对转基因玉米T4-1-1外源基因插入的纯合/杂合状态的检测方法，其步骤为：

(1)提取待检测水稻样品的DNA；

(2)以上述提取的DNA为模板，以SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的核苷酸序列为扩增引物，建立PCR扩增体系，并进行PCR扩增；

如果仅扩增出一条SEQIDNo.3所示核苷酸序列的片段，鉴定为纯合转基因玉米T4-1-1；

如果扩增出分别为SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示核苷酸序列的两条片段，鉴定为杂合转基因玉米T4-1-1；

如果仅扩增出一条SEQIDNo.4所示核苷酸序列的片段，鉴定为不是转基因玉米T4-1-1。

其中，所述的从待检测玉米样品中提取DNA的方法，可以是从植物材料中提取DNA的各种常用方法，例如可以是CTAB法、SDS法或经验证适用于植物DNA提取的试剂盒等各种方法。

本发明中所述的PCR扩增体系可参考以下方法建立：反应体系的总体积为25.0μL，其中，10×LATaqBufferII(Mg²⁺Plus)缓冲液2.5μL，TaKaRaLATaq(5U/μl)聚合酶0.25μL，dNTPMixture(2.5mMeach)4.0μL，10μmol/LSEQIDNo.1所示的引物1μL，10μmol/LSEQIDNo.2所示的引物1μL，25ng/μLDNA模板2μL，余量为双蒸水。

所述的PCR扩增条件优选为：94℃变性1min；(94℃20s，65℃5min)30个循环；72℃延伸5min。

本发明还提供了一种用于转基因玉米T4-1-1外源基因插入的纯合/杂合状态的PCR检测试剂盒，其特征是包括有一对PCR检测引物，所述引物的核苷酸序列分别为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。

本发明检测方法能够准确的检测出转基因玉米T4-1-1外源基因插入的纯合/杂合状态，为转基因玉米T4-1-1成分检测标准物质研制、转基因定量检测、样品鉴定奠定了基础。

附图说明

图1PCR方法鉴定转基因玉米T4-1-1纯合体琼脂糖凝胶电泳图；其中

M：Trans2KplusIIDNAMarker；1：空白对照；2：T4-1-1纯合体；3：T4-1-1受体和T4-1-1纯合体混合样品；4：阴性对照。

具体实施方式