[发明专利]制备毛癣菌扫描电镜样品的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种毛癣菌扫描电镜样品的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

样品的前处理是电镜观察的必备过程，其处理效果的好坏直接关系到电镜观察的结果。

由于毛癣菌的菌丝均呈团状，且有些较厚，在样品处理过程中，存在着与试剂接触不充分的现象，导致样品处理不均匀，结果无法准确判断。通过多次的重复实验发现，电镜制样过程中最重要的一步是固定，若是固定效果不好，后续处理也难以起到很好地改善作用。

目前最常用的方法为戊二醛-锇酸(四氧化锇)双重固定，但锇酸是剧毒物品，接触或吸入可导致头痛、呼吸道炎症、眼病、支气管病、肺炎等，对实验人员的健康构成严重的潜在威胁，有必要研究一种低毒的固定方法以代替传统的双重固定法。也有研究单用戊二醛固定，但易使菌体皱缩，难以取得令人满意的效果。

发明内容

本发明研究了一种毛癣菌扫描电镜(SEM)样品的制备方法，本发明的核心在于：样品固定时，用戊二醛溶液处理的同时应用超声辅助处理。

超声辅助处理是指：将盛有样品和3％戊二醛溶液的容器，如EP管，置于超声清洗仪中处理一段时间。

优选地，戊二醛溶液的浓度为3％。

进一步优选地，本发明的固定步骤为：取样品，加入3％戊二醛溶液，然后用超声清洗仪清洗超声辅助处理，接着在4℃条件下3％戊二醛溶液过夜处理，进入后续常规处理步骤。

过夜处理为本领域技术人员常用的术语，一般指下午或晚上进行实验操作，然后继续处理一晚上，到第二天进行下一实验步骤，通常处理时间超过8h。

优选地，超声处理的率为60W。

优选地，超声处理的时间为60～90s。

进一步优选地，超声处理的时间为60s。

本发明较佳的固定方法为：取样品，加入3％戊二醛溶液，然后将超声清洗仪功率调整为60W超声辅助处理60s，接着在4℃条件下3％戊二醛溶液过夜处理，进入后续常规处理步骤。

本发明的方法可用于各种毛癣菌，用于须癣毛癣菌效果为最佳。

通常微生物菌丝用于扫描电镜样品的制备包括菌丝活化、样品准备、固定、清洗、脱水、喷金等各种步骤。

本发明集中于解决其中最核心的问题，即样品的固定问题，其他各步骤可参照一般的样品处理方法。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或变更。

以下通过具体实施例的形式，对本发明的上述内容再做进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1各不同固定处理SEM观察结果

具体实施方式

实施例1：须癣毛癣菌扫描电镜样品的制备

1材料与试剂：

1.1实验材料：须癣毛癣菌(Trichophytonmentagrophytes)

1.2试剂：蛋白胨、葡萄糖、琼脂、pH7.2的磷酸缓冲液(PBS)、25％戊二醛、乙醇、丙酮、叔丁醇

1.3主要实验仪器：超净工作台、培养箱、移液器、冰箱、高压灭菌锅、超声清洗仪(AS3120A，220V，120W，天津奥特赛恩斯仪器有限公司)

1.4样品准备

1.4.1菌丝活化

SDA平板配制：称取蛋白胨10g、葡萄糖20g、琼脂18g，定容至1L，121℃、灭菌30min，在培养基凝固之前倒平板，备用；

菌种活化：将菌种接种于平板上，在30℃的培养箱中培养5～7天，备用。

1.4.2样品准备：取活化的菌种接种于无菌的SD培养基(除去SDA培养基中的琼脂即可)中，30℃的培养箱中培养5～7天，备用。

1.5制样方法：

(1)取样：取适量同一生长周期的菌丝于2mL的EP管中，用纯水清洗2～3次，除去菌丝表面的培养基及其它杂质；

(2)固定：将上述清洗后的菌丝分别按照表1中戊二醛的浓度进行固定处理，A～E分别加入各自浓度的戊二醛，放到4℃的冰箱过夜即可；F～I按表1中对应的方法处理，即取样品，加入3％戊二醛溶液，然后用超声清洗仪清洗超声辅助处理相应的时间，接着在4℃条件下3％戊二醛溶液过夜处理。

各组处理方法见表1：

表1各组固定处理步骤