[发明专利]一种来源于丁香假单胞菌的山梨醇脱氢酶基因及其应用

说明书

本发明公开了一种来源于丁香假单胞菌的山梨醇脱氢酶基因及其应用，基因核酸序列如SEQ ID NO：1所示，通过构建重组载体并在大肠杆菌中克隆表达，该基因编码的山梨醇脱氢酶氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。山梨醇脱氢酶能高效催化多种重要多元醇与其对应的酮糖的转化，山梨醇脱氢酶对底物的转化率均大于99%，相较于传统依赖异构酶的生产方法，大大降低了后期分离、脱色成本，具有重要的工业应用价值。

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种来源于丁香假单胞菌的山梨醇脱氢酶基因及其应用。

背景技术

山梨醇脱氢酶（Sorbitol dehydrogenase, 简称SDH, EC 1.1.1.14）广泛存在于微生物、植物以及动物之中，最早由Breusch, F. L.等发现于猫肝脏中（1942），是生物体内多元醇途径中的关键酶。未经细胞利用的葡萄糖进入多元醇通路时，醛糖还原酶首先将其还原为山梨醇，同时氧化NADPH生成NADP⁺。继而，SDH利用NAD⁺作为氢受体氧化山梨醇C2位的羟基生成果糖，果糖通过己糖激酶的磷酸化作用形成6-磷酸-果糖返回糖酵解途径。目前，研究者已考察了数十种不同来源的山梨醇脱氢酶，研究方向涉及与植物的滞育关系、与二型糖尿病的相关性、多元醇的生物转化等等，然而直到2003年，才由Philippsen, A.、Pauly, T.A等人相继利用X光衍射和晶体拓扑学分析得到首个微生物来源及人来源的SDH晶体及亚结构，分别属于短链脱氢酶家族、中链脱氢酶家族。

SDH大多为多聚体酶，是由相同或相似的亚基组成的二聚体、三聚体或四聚体，单亚基的分子量为25~60 kDa，能不同程度的氧化D-山梨醇，L-艾杜糖醇，D-半乳糖醇等多元醇C2位的羟基生成相对应的酮糖。在酶法检测方面，SDH可以用于快速、精确检测山梨醇的含量。在食品及其他复合材料领域，D-山梨醇是一种重要的大吨位原料，而在临床上，D-山梨醇则是糖尿病监测的重要指标。从羊肝脏、Bacillus subtilis中分离的SDH由于具有广泛的底物特异性，很难区分样品中的木糖醇（结构与山梨醇类似）；Schneider等从Pseudomonas sp.分离出对木糖醇低活性（仅为山梨醇的2%）的SDH，但因产率低并不适合工业应用；而后，Ikuko Masuda等从Pseudomonas sp. KS-E1806克隆了一条SDH基因并构建基因工程菌用于山梨醇脱氢酶的高效生产，同时申请了欧洲、美国、日本的专利保护（专利号：EP1262551 (A3)、US2003022336 (A1)、JP2002355046 (A)）。此外，SDH在酶法生产D-果糖或D-塔格糖方面，也具有潜在的工业应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种来源于丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）的山梨醇脱氢酶基因及其应用，该基因编码的山梨醇脱氢酶能催化多元醇与相应酮糖相互转化，至今未发现该山梨醇脱氢酶基因的相关研究的报道。

来源于丁香假单胞菌的山梨醇脱氢酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因序列含有774 bp碱基。

所述的山梨醇脱氢酶基因编码的山梨醇脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其包含257个氨基酸。

一种表达载体，它包含所述的山梨醇脱氢酶基因。

一种重组菌，其是通过利用所述的表达载体转化宿主细胞获得的。

用细菌DNA Kit (TIANGEN, China)提取丁香假单胞菌基因组，基于如SEQ ID NO：1所示的核酸序列设计引物，扩增的DNA片段克隆到pET-28a载体中，将所构建的重组质粒pET-28a-sdh转化到大肠杆菌 BL21中构建工程菌，通过适宜浓度的IPTG诱导基因工程菌高效表达山梨醇脱氢酶。