[发明专利]一种融合细胞及其制备方法和其作为肿瘤疫苗的应用

权利要求书

1.一种融合细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备NDV-Ulster病毒株修饰的肿瘤细胞

将肿瘤细胞灭活，在灭活的肿瘤细胞中按照每(1-2)×107个灭活的肿瘤细胞中加入NDV-Ulster病毒株32个血凝单位的比例加入NDV-Ulster病毒株，得混合物，将混合物移入培养瓶中，在培养瓶中加入无血清细胞培养基并于37℃、5％CO2的条件下培养0.5-2小时，离心收集NDV-Ulster病毒株修饰后的肿瘤细胞，洗涤并进行无菌检验，无菌检验阴性为合格；

(2)制备采用磷酸抗原或双膦酸盐类药物刺激活化的新型抗原递呈细胞γδT-APC

从脐带血中分离单个核细胞后，用含2-10％所述脐带血血浆的无血清细胞培养基将单个核细胞稀释到(1-2)×106个/ml，置于培养瓶中，并向培养瓶中加入磷酸化抗原或双膦酸盐类药物刺激活化单个核细胞，使磷酸化抗原或双膦酸盐类药物浓度为1-10μM，将培养瓶置于37℃、5％CO2的条件下培养18-24h后，再在培养瓶中加入重组人白细胞介素-Ⅱ，使其浓度为100-1000U/ml，每隔2-3天继续补充所述含2-10％所述脐带血血浆的无血清细胞培养基并补充重组人白细胞介素-Ⅱ，使重组人白细胞介素-Ⅱ浓度保持为100-1000U/ml，如此总共培养7-14天，即可获得活化的γδT-APC，离心将γδT-APC收集起来，对活化的γδT-APC细胞进行微生物、细胞活率及免疫表型的检测，微生物检测阴性，细胞活率＞85％，目标免疫表型的阳性率均＞80％才能用于融合细胞的制备；

(3)制备γδT-APC和NDV-Ulser修饰的肿瘤细胞的融合细胞

使用不同荧光染料标记的抗体对步骤(1)所得NDV-Ulser修饰的肿瘤细胞以及步骤(2)培养的γδT-APC进行染色，每2×105个γδT-APC中加入(1-2)×106个NDV-Ulster修饰的肿瘤细胞进行融合，获得融合产物；

其中，细胞融合的方法为电融合法，所述电融合技术的步骤为:γδT-APC和肿瘤细胞组成的混合细胞在融合介质中进行洗涤，所述融合介质为：含50g/L葡萄糖、0.5mmol/L醋酸镁、0.1mmol/L醋酸钙、3g/L牛血清白蛋白,pH7.2的水溶液,随后将混合细胞重悬于所述融合介质中,细胞浓度为(1-1.5)×107个/ml，融合过程由电融合仪来完成，把细胞放入电融合槽中,用交流电120V/cm冲击细胞悬液10秒使得γδT-APC和肿瘤细胞各自排列成两排，然后立即将交流电改为直流电1100V/cm冲击25微秒，进行细胞融合；

(4)纯化融合细胞

将步骤(3)所得融合产物通过流式细胞荧光分选技术纯化获得含有步骤(3)中使用的各种抗体的融合细胞；

(5)融合细胞的培养：将步骤4获得的经过纯化的融合细胞置于培养瓶中，加入所述含2-10％所述脐带血血浆的无血清细胞培养基，并加入重组人白介素-2使其浓度为100-1000U/ml，于37℃、5％CO2的条件下培养18-24h，得培养物；

(6)融合细胞产品的制备：将步骤(5)所得培养物离心去上清，沉淀洗涤后收集融合细胞产品，对融合细胞产品进行活细胞计数和微生物检测，存活率＞85％为合格，微生物检测阴性为合格；

上述步骤(2)中所述目标免疫表型为HLA-DR、HLA-A、CD80、CD86和CD11c；步骤(4)中所述目标免疫表型为HLA-DR、HLA-A、CD80、CD86、CD11c和MUC1。

2.根据权利要求1所述的融合细胞的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，将培养瓶置于37℃、5％CO2的条件下培养18-24h后，再在培养瓶中加入重组人白细胞介素-Ⅱ，使其浓度为1000U/ml。