[发明专利]番石榴炭疽病菌特异性PCR检测引物及其检测方法

说明书

本发明提供番石榴炭疽病菌特异性PCR检测引物及其检测方法，所述引物包括上游引物CGF：5'‑CGGGTAGGGTCTCCGTGA‑3'和下游引物CGR：5'‑CCCAGTGCGAGACGT AAAGT‑3'，在所述引物的基础上建立番石榴炭疽病菌PCR检测方法，经琼脂糖凝胶电泳，可在番石榴炭疽病菌纯DNA、带番石榴炭疽病菌的发病组织中特异性地扩增出片段大小为390 bp的扩增产物。本发明的检测引物和检测方法检测番石榴炭疽病菌具有准确性高、特异性强、灵敏度高、检测过程操作简便快速的优点，可用于田间番石榴炭疽病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为番石榴炭疽病的防治提供可靠的技术和理论依据。

技术领域

本发明涉及番石榴炭疽病菌特异性PCR检测引物及其检测方法，专用于番石榴炭疽病菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于田间番石榴炭疽病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域。

背景技术

由胶孢炭疽菌（Colletotrichum glosoporioides）侵染引起的番石榴炭疽病是世界热带和亚热带地区番石榴采前和采后的重要病害，在世界各地，每年番石榴因此病损失达到5%～15%。番石榴通常在成熟早期感染此病，但病原菌保持体眠，一直到果实成熟后才有病害症状的发展，成熟果实上最初的症状是产生暗褐色、圆形凹陷的病斑，这些病斑通常合并在一起产生大的腐烂区域。在田间，炭疽病使未成熟和成熟的果实腐烂，但成熟果实表现得更严重，在采收期间和采后造成的形态上和生理上的受损点通常被“创口病原菌”侵入，这一系列病原菌导致最具毁灭性的采后病害，番石榴炭疽病菌就是其中之一，因此，快速、准确地在发病前或初期以及收获时对病菌的侵染动态进行监测，及时采取有效的防治方法对控制病害在田间和储运中的发生，减少经济损失具有十分重要的意义。

传统炭疽病菌的分类与鉴定主要基于形态学特征及致病性测定等，这种鉴定方法耗时较长、程序繁琐、灵敏度低以及经验性强，从发病植株中分离并鉴定病原菌需要数天时间，难以做到对病害发生及时监测和有效控制病原菌的传播与病害流行。同时，传统的检测方法在果实储藏和运输之前不能明确炭疽病菌潜伏侵染的状况，造成已被炭疽病菌侵染的番石榴果实在储运过程中大量腐烂，产生巨大损失。随着分子生物学技术的发展，利用真菌核糖体转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）序列种内的保守性和科属种间可变性的特点，设计特异性引物进行聚合酶反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增，从而达到对病原菌进行快速检测和鉴定的技术已受到广泛的应用。国内外已有研究人员利用核糖体转录间隔区（ITS）基因为病原菌检测靶标，开发出了灰霉菌、疫霉菌、枯萎病菌、链格孢等不同病原真菌的特异性检测引物，并利用特异性引物进行PCR扩增，达到病原菌快速、准确的检测和鉴定。目前，尚未见有关番石榴炭疽病菌（Colletotrichum glosoporioides）分子检测的报道。本发明通过对炭疽菌属（Colletotrichum）的ITS序列进行比对分析，设计出1对可用于特异性检测番石榴炭疽病菌的引物，为番石榴炭疽病菌的准确鉴定和快速检测提供技术和方法，有利于及早有效地采取防治措施。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中对番石榴炭疽病菌检测和鉴定，主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行以及采后病害造成腐烂变质的问题，提供了一种番石榴炭疽病菌特异性PCR检测引物及其检测方法，利用本发明所述的PCR检测引物和检测方法检测番石榴炭疽病菌准确性高、特异性强、灵敏度高、易于操作、检测时间短且结果可靠。

实现本发明的目的包括下列步骤（技术方案）：