[发明专利]一种单分子靶向测序方法、装置、系统及应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别是涉及一种单分子靶向测序方法、装置、系统及应用。

背景技术

二代测序技术广泛应用在很多领域，但其内在缺陷带来诸如起始样品量大，测序时间长，费用高，PCR扩增过程带来的测序错误等开始凸显。以直接针对单个DNA分子的测序技术(SMS)为特征的新三代测序技术则针对解决二代技术的缺陷应运而生，并越来越多的引起人们的关注。

世界上首个基于单分子测序技术(tSMS)的测序仪是由Helicos公司于2008年推向市场的。其原理是通过检测单个碱基荧光信号来实现边合成边测序。具体而言，在测序前，待测DNA被打断成约200bp的片段，并需要在片段3’末端加上40bp带有荧光标记的poly(A)尾，文库退火形成单链，与芯片上固定的OligodT(40bp)探针结合。Helicos公司在2012年发表的学术论文则进一步改进了此项技术，把待测的带荧光，但无polyA尾修饰的单个DNA分子杂交捕获在特定的探针上面进行直接测序。其结果显示出此项技术潜在的应用前景，尤其是临床应用领域。但Helicos公司发布的产品由于其高昂的价格和不稳定性等特点，没有得到市场的认可，于2011年底破产。

此外，太平洋生物公司的单分子测序仪(SMRT)具有读长长等特点，但是受物理原件和制作工艺的局限，该仪器通量不高，试剂昂贵，尚未真正应用到临床。因此，利用单分子技术的优势以及临床需求而开发的单分子靶向测序技术(SMTS)，有望成为应用于遗传病检测和精准医疗市场新一代测序仪器。

发明内容

鉴于此，本发明提供了一种单分子靶向测序方法、装置、系统及应用。本发明提供的单分子靶向测序方法、装置、系统用于对任何一条或多条DNA、RNA、mRNA、染色体、基因组、或其他核酸序列进行快速和准确地测序。

第一方面，本发明提供了一种单分子靶向测序方法，包括：

(i)将靶向引物的5’端连接到基底表面；

(ii)将末端修饰有光学检测标记的模板核酸与所述步骤(i)中连接到基底表面上的靶向引物进行杂交，形成杂交的靶向引物/模板核酸复合物；

(iii)对所述靶向引物/模板核酸复合物进行成像；

(iv)将所述靶向引物/模板核酸复合物、聚合酶以及一种或多种带光学检测标记的核苷酸混合，通过聚合酶反应将一种或多种带光学检测标记的核苷酸添加至靶向引物链的3’端；获得延伸产物；

(v)对延伸后的靶向引物/模板核酸复合物进行成像，并结合步骤(iii)中靶向引物/模板核酸复合物的定位结果，进行图像比对和纠偏，以鉴定模板核酸上的待测核苷酸序列；

(vi)除去延伸产物上带光学检测标记的核苷酸的可断裂的基团：

(vii)重复步骤(iii)至(vi)一次或多次以鉴定所述模板核酸中的1个或多个核苷酸。

本发明通过延伸反应、成像检测和切除光学检测标记分子的反复循环，实现SMTS实时测序。

在本发明一实施例中，所述步骤(i)中，靶向引物为5’端具有10-30bp的polyT的引物序列，其中，所述引物序列为与模板核酸的至少部分序列互补的序列。

在该实施例中，靶向引物为5’端连接到基底表面的方式为：polyT的5’端连接到基底表面。

在本发明一实施例中，所述步骤(i)中，靶向引物为与模板核酸的至少部分序列互补的序列。

在该实施例中，靶向引物为5’端连接到基底表面的方式为：polyT的5’端连接到基底表面。

在本发明一实施例中，所述步骤(i)中，靶向引物为5’端顺次连接有10-30bp的polyT以及烷基链的引物序列，其中，所述引物序列为与模板核酸的至少部分序列互补的序列。

优选地，所述烷基链为-(CH₂)_n-(优选为-(CH₂)₆-)，其中，n为自然数。

在该实施例中，靶向引物为5’端连接到基底表面的方式为：-(CH₂)₆-通过氨基与基底表面的环氧基连接。

在本发明一实施例中，靶向引物为通过5’端修饰的氨基连接到表面修饰有环氧基基底(包括但不限于玻璃基底、石英基底等)。在本发明一优选实施例中，将带有光学检测标记的靶向引物的5’端连接到基底表面的步骤包括：

a)将环氧基修饰的玻璃基底浸泡在含0.4-3.2nM靶向引物的固定液中(优选45min-120min)；清洗基底；