[发明专利]M蛋白三氨基酸位点突变的猪用VSV病毒载体构建和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株基质蛋白(M)三氨基酸位点突变的新型猪用水泡性口炎病毒载体的构建和应用。

背景技术

家畜水泡性口炎由水泡性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus,VSV)引起，是一种急性、高致病性传染病，可在全世界范围内对畜牧业造成危害，在我国被列为二类动物传染病，目前尚无有效的疫苗予以预防。

水泡性口炎由水泡性口炎病毒(VSV)引起，可使牛和猪致死。受感染的动物表现为发热、嗜睡、食欲下降；口腔、乳头、趾间及蹄冠上出现水泡性病灶和腿部的罐状环带。水泡易破裂，露出肉芽组织，呈红色糜烂，常在7～10天内完全痊愈。水泡性口炎直接导致动物死亡较少，但可造成局部继发细菌和真菌感染，从而导致跛行、体重下降、出奶下降和乳腺炎等，带来重大经济损失。VSV可在全世界范围内对畜牧业造成危害，迄今仍无有效的疫苗予以预防。我国目前还不是该病毒的疫区，但研制有效疫苗预防该病仍有一定必要。灭活疫苗免疫的动物，抗体产生速度慢，需反复接种，不适合在疫情出现时应急免疫之用，且通常难以有效激发CD8T细胞介导的细胞毒性T细胞反应(CTL)及粘膜免疫应答。利用减毒活疫苗是克服这些困难的有效方法之一。

目前应用于猪的病毒疫苗载体主要包括腺病毒和伪狂犬病毒[8,9]，均属于DNA病毒。水泡性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus,VSV)则是一种新型RNA病毒载体，属于弹状病毒科，其天然宿主为猪和牛等家畜动物,基因组是一条单链负义RNA分子，长度约为11kb,由5个基因组成，分别编码病毒的核衣壳蛋白(N)、磷酸化蛋白(M)、囊膜蛋白(G)和病毒RNA复制酶(L)，其中VSVG蛋白负责识别病毒受体并介导病毒入侵宿主细胞，它决定了病毒的嗜性。1996年，JohnRose课题组建立了VSV的体外挽救(rescue)技术[10]，为研制新型水泡性口炎病毒载体提供了新的思路。VSV病毒载体的优势在于:1.载体基因组中可插入多个外源基因同时进行高效表达,并可激发机体产生全面的免疫保护力,尤其是细胞免疫和粘膜免疫；2.繁殖速度快，易于大规模培养。

近年来,WHO等国际组织提出要发展一种理想疫苗，使其具有安全、高效、多价、应用方便等特点，基于致弱病毒的活载体疫苗是一个方向，因为病毒载体表达的外源抗原可高效和全面地激发机体免疫应答。弱化病毒的获取通常有几种方法,(1)自然弱化的病毒株，如麻疹病毒的Edmonson株；(2)经非天然宿主动物或细胞反复传代致弱，如痘苗病毒安卡拉株(MVA)是野毒经鸡胚成纤维细胞(CEF)传代570次以上得到的高度致弱毒株；近年来，利用基因工程技术对野生型病毒进行人工弱化正在成为趋势，主要策略包括:(1)假型化改造(pseudotyping)，即改变病毒天然嗜性，如利用VSV病毒载体表达Ebola病毒囊膜蛋白开发的人用疫苗[3]；(2)利用特定细胞中活化的启动子，如在肿瘤细胞中具有高活性的端粒酶基因启动子(telemerasepromoter)去控制病毒复制必须基因，使得病毒只能在特定细胞如肿瘤细胞中复制，而在正常细胞中不复制，从而达到减毒目的；(3)利用组织特异性表达的MicroRNA分子为减低病毒的毒性提供了新途径。MicroRNA是一类具有组织表达特异性的转录后调控分子，不同的MicroRNA在不同组织中的分布存在差异，如StephenRussell等利用肌肉组织特异性miR133a识别序列开发的柯萨奇病毒载体，去除了野生型病毒对肌肉组织的毒性。

VSV是一种有前途的病毒载体，具有很多的优点，但野生型VSV所存在的毒性限制了其临床运用，有必要加以该进，去除其致病性。在之前的研究中，参见中国专利CN201410029722.X,公开了一株基质蛋白突变的重组水泡性口炎病毒作为猪用疫苗载体；所述疫苗载体为重组病毒VSVΔM51，该病毒的基质蛋白(M)的第51位氨基酸甲硫氨酸被敲除。并在国内外首次对VSVΔM51在猪上的致病性进行了较为系统的评估，为VSVΔM51作为疫苗载体提供了证据。但是，从其结果来看，虽然VSVΔM51较野生型VSV病毒已有一定程度的弱化，但是仍表现出一定的致病性，仍需进一步地改造以提高其安全性。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一株基质蛋白(M)三氨基酸位点突变的新型猪用水泡性口炎病毒，通过对重组病毒VSVΔM51进一步改造，获得致病性极低，安全性高，并且能有效激发机体产生保护性免疫应答反应，具有良好的应用前景的新型猪用水泡性口炎病毒载体。

本发明是通过以下技术方案实现的：