[发明专利]M蛋白三氨基酸位点突变的猪用VSV病毒载体构建和应用

权利要求书

1.一种猪用水泡性口炎病毒载体，其特征在于，所述载体为M蛋白三氨基酸位点发生突变的重组病毒VSV-M_T，所述M蛋白的第51位甲硫氨酸被敲除,第221位缬氨酸突变为苯丙氨酸，第226位甘氨酸突变为精氨酸。

2.一种如权利要求1所述的猪用水泡性口炎病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、三氨基酸位点发生突变的VSVM基因M_T的制备：以pVSVΔM51质粒为PCR扩增模板，采用重叠PCR方法对M蛋白221和226位氨基酸进行定点突变，得到M_T；

S2、pVSV-M_T质粒构建：对S1获得的M_T经XbaI和MluI双酶切后克隆到pVSVΔM51质粒，获得pVSV-M_T质粒；

S3、M蛋白三位点突变的VSV-M_T病毒的构建：用表达T₇RNA聚合酶的痘病毒vTF7-3感染BHK-21细胞并孵育；同时制备质粒转染混合液，其中包括质粒pBS-N、pBS-P、pBS-L及pVSV-M_T，将质粒进行转染；转染后吸取上清，滤去痘病毒，将滤液加入到对数生长期的BHK-21细胞中，待细胞出现病变情况，收集上清，进行病毒鉴定即得。

3.如权利要求2所述的猪用水泡性口炎病毒载体的构建方法，其特征在于，所述S1中，重叠PCR方法所需4条引物设计为：引物1如SEQIDNo.1所示，引物2如SEQIDNo.2所示，引物3如SEQIDNo.3所示，引物4如SEQIDNo.4所示。

4.如权利要求3所述的猪用水泡性口炎病毒载体的构建方法，其特征在于，所述的重叠PCR方法为先用引物1与引物2扩增出片段1，引物3和引物4扩增出片段2，用胶回收试剂盒回收片段1和片段2，DNA定量后按1:1比例混合所述片段1、片段2并作为模板，再用引物1和引物4进行第二轮PCR。

5.如权利要求4所述的猪用水泡性口炎病毒载体的构建方法，其特征在于，所述片段1大小应为871bp,包含M蛋白基因的上游部分和部分P蛋白基因；所述片段2大小应为179bp,包含M蛋白基因及下游部分序列；所述片段1与片段2有50bp的重叠序列。

6.如权利要求3所述的猪用水泡性口炎病毒疫苗载体的构建方法，其特征在于，所述引物1上具有XbaI酶切位点，引物4上具有MluI酶切位点。

7.如权利要求2所述的猪用水泡性口炎病毒载体的构建方法，其特征在于，所述S3中，痘病毒vTF7-3感染BHK-21细胞的接种量为MOI＝5，孵育时间为1小时。

8.如权利要求2所述的猪用水泡性口炎病毒载体的构建方法，其特征在于，所述S3中，转染时间为48h。

9.如权利要求2所述的猪用水泡性口炎病毒载体的构建方法，其特征在于，所述S3中，用0.22μm的滤膜滤去痘病毒。

10.一株如权利要求1所述的猪用水泡性口炎病毒载体在制备疫苗或疫苗载体中的用途。