[发明专利]用于果汁中脂环酸芽孢杆菌PCR检测的引物及其应用

说明书

技术领域

本发明属于食品微生物检测技术领域，具体涉及用于果汁中脂环酸芽孢杆菌PCR检测的引物及其应用。

背景技术

脂环酸芽孢杆菌(Alicylobacillusspp.)是一类嗜酸、耐热的革兰氏阳性芽孢杆菌的统称，杆状、产芽孢，且严格需氧。这类细菌可以生长的pH值范围为2.0-6.0，最适pH值为3.0-5.0；可以生长的温度范围为20-60℃，最适生长温度为45-50℃。由于这类细菌可以耐受普通的巴氏杀菌，可以在低pH值及高温条件下存活甚至生长，因此这类细菌也称为“嗜酸耐热菌”。脂环酸芽孢杆菌可以在果汁中生长代谢产生愈创木酚、2，6-二溴苯酚、2，6-二氯苯酚等物质，使果汁的口感、风味变差并形成白色沉淀或雾状浑浊。因此，脂环酸芽孢杆菌是果汁产业中关键的质量安全因子之一，对果汁的生产加工及出口贸易构成了严重威胁。

目前，国际通用的脂环酸芽孢杆菌检测方法依然是培养法，虽然其简单易于操作，但工作量大、耗时长、检测严重滞后于生产实际。同时，研究开发的常规PCR、TaqMan实时荧光定量PCR、傅里叶变换红外光谱和电子鼻等检测方法主要针对于A.acidoterrestris，且尚未真正应用于食品工业实际样本的分析。因此，适用于脂环酸芽孢杆菌快速检测的方法较少，研究建立高效、快速的检测方法，及时识别与发现果汁中脂环酸芽孢杆菌污染，切实保障果汁品质及质量安全，一直是工业化生产和科研工作者研究的热点。

发明内容

针对现有技术中的缺陷和不足，本发明设计了一种用于果汁中脂环酸芽孢杆菌PCR检测的引物，并将其应用在果汁中脂环酸芽孢杆菌的SYBRGreenI荧光定量PCR检测方法中。

为了实施上述目标，本发明采用的主要技术方案如下：

一种用于果汁中脂环酸芽孢杆菌PCR检测的引物，该引物根据脂环酸芽孢杆菌16SrDNA基因序列的保守区域设计获得，该引物包括上游引物序列SEQIDNO.1和下游引物序列SEQIDNO.2；

所述的上游引物序列SEQIDNO.1为5’-ATGCGTAGATATGTGGAGGA-3’；

所述的下游引物序列SEQIDNO.2为5’-CAGGCGGAGTGCTTATTG-3’。

所述的引物在果汁中脂环酸芽孢杆菌PCR检测中的应用。

具体的，所述的果汁中脂环酸芽孢杆菌PCR检测为果汁中脂环酸芽孢杆菌的SYBRGreenI荧光定量PCR检测。

更具体的，检测方法包括采用免疫磁性分离技术进行果汁样品的预处理，然后利用权利要求1中的引物进行果汁样品中脂环酸芽孢杆菌的SYBRGreenI荧光定量PCR检测。

再具体的，所述的SYBRGreenI荧光定量PCR检测方法的模板为脂环酸芽孢杆菌样品总DNA，SYBRGreenI荧光定量PCR检测方法的反应体系包括无菌超纯水、SYBRGreenIPremixEx-Taq^TM、上游引物序列SEQIDNO.1、下游引物序列SEQIDNO.2和脂环酸芽孢杆菌样品总DNA。

进一步的，所述的反应体系包括12.5μL的SYBRGreenIPremixEx-Taq^TM、0.5μL的浓度为10μM上游引物SEQIDNO.1、0.5μL的浓度为10μM下游引物SEQIDNO.2、1.0μL的脂环酸芽孢杆菌样品总DNA和10.5μL的无菌超纯水。

一种用于果汁中脂环酸芽孢杆菌PCR检测的试剂盒，该试剂盒中含有权利要求1所述的上游引物序列SEQIDNO.1和下游引物序列SEQIDNO.2。

与现有技术相比，本发明的优点为：

本发明对脂环酸芽孢杆菌中10个不同属共15个种的16SrDNA基因序列进行比较，并设计了基于脂环酸芽孢杆菌保守区域的引物。通过软件评价和对实际菌株的检测，说明获得的引物和建立的方法具有非常好的扩增特异性。本发明建立的SYBRGreenI荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强，可以简单快速的判断样品中是否含有脂环酸芽孢杆菌，具有非常广阔的应用前景。

附图说明

图1是对脂环酸芽孢杆菌进行16SrDNA基因序列分析，在此基础上进行引物设计(以A.acidoterrestrisDSM-3923为例，其中，→为上游引物FP，←为下游引物RP)；

图2是SYBRGreenI荧光定量PCR的特异性评价结果图；图2(A)和图2(B)分别表示不同种菌体的PCR扩增曲线和熔解曲线图；