[发明专利]绿壳蛋鸡啄羽相关基因检测用试剂盒及其实现方法

权利要求书

1.一种绿壳蛋鸡啄羽相关基因检测用试剂盒，其特征在于，包括：

1)用于PCR扩增以检测rs13640917基因用的引物对，即上游引物U和下游引物D，其中：

U如Seq ID No.1所示，即：5’‐CACAATGACCACGACAACG‐3’；

D如Seq ID No.2所示，即：5’‐ATCTCACGGAACCCAAATG‐3’；

2)限制性核酸内切酶AcuI，其序列为：

5’‐CTGAAG(N)16↓‐3’以及3’‐GACTTC(N)14↑‐5’

其中箭头所指位置为酶切位点，N表示任何碱基。

2.一种根据权利要求1所述试剂盒的实现方法，其特征在于，对待测鸡只的包括rs13640917C/T突变在内的基因组DNA为模板，采用所述引物进行PCR扩增，再用限制性核酸内切酶AcuI酶切所得的PCR扩增产物，电泳检测所得到的酶切产物并判断待测鸡只的rs13640917位的脱氧核糖核苷酸是野生型C或突变型T。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的判断具体为：当电泳显示为两条带，即酶切产物为106bp和295bp两个片段，表示所述待测鸡只的基因型为CC，是野生型纯合体；当电泳显示为一条带，即酶切产物为401bp一个片段，表示所述待测鸡只的基因型为TT，是突变型纯合体；当电泳显示为三条带，即酶切产物为106bp、295bp及401bp三个片段，所述待测鸡只的基因型为CT，是杂合体。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的PCR扩增，其扩增体系包括：鸡基因组DNA50ng、上、下游引物10pmol/L各0.3μL、Taq Mix7.5μL，并用ddH₂O补充反应体系至15μL；PCR反应条件为：95℃变性5min；循环程序为95℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的酶切，其反应体系包括：PCR反应混合物4μL、10×酶切缓冲液1μL、内切酶AcuI10U/μL0.4μL、ddH₂O4.6μL，反应体系总体积10μL；通过恒温水浴37℃孵育1小时。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的电泳检测是指：对酶切产物进行1.5％琼脂糖凝胶电压8V/cm，时间30min的电泳，并通过凝胶成像系统观察结果。