[发明专利]一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中猫肉的LAMP检测方法

说明书

本发明涉及一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中猫肉的LAMP检测方法，属于分子生物学检测技术领域。本发明的检测方法以待测肉品的DNA作为模板、以MF3、MB3、MFIP、MBIP为引物构建LAMP检测体系；LAMP检测体系于64℃恒温水浴中LAMP反应40min，反应结束后向反应液中加入1uL荧光染料SYBR GREENⅠ；若反应液变成绿色，说明待测肉品中存在猫肉；若为橘黄色，则待测肉品中不存在猫肉。本发明的检测方法与传统PCR相比，在普通恒温水浴锅中反应40min即可完成，而且可以通过在终产物中加入染料的方法直接用肉眼观察结果，能快速准确地鉴定出动物源性成分；具备操作简便、对实验仪器要求较低、结果判定容易的优点。

技术领域

本发明涉及一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中猫肉的LAMP检测方法，属于分子生物学检测技术领域。

背景技术

近年来随着市场对牛羊肉的需求逐渐增加及价格快速上涨，一些不法商贩在利益的驱动下，掺加其他廉价肉造假冒充牛羊肉。2012年以来，国内曝光了多起以猪肉、鸡肉、鸭肉冒充牛羊肉的事件；更有甚者，在牛羊肉中还掺入病死的狗肉和猫肉。这种现象不仅扰乱了经济秩序，而且严重危害人们身体健康。

目前，用于动物源性成分检测的方法主要有常规PCR、荧光定量PCR等，但上述诊断方法花费时间较长，而且判定结果需要借助精密仪器设备，难以在实际生产中普及应用。

发明内容

为了解决采用常规PCR、荧光定量PCR法检测牛羊肉中掺入猫肉时所存在的上述技术问题，本发明利用LAMP技术和动物线粒体DNA上细胞色素C氧化酶亚单位Ⅰ（COXⅠ）基因对猫肉进行鉴定，整个反应在恒温水浴锅中进行40min即可，而且可以通过在终产物中加入染料的方法直接用肉眼观察结果。

本发明的技术方案是：

一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中猫肉的LAMP检测方法，

以待测肉品的DNA作为模板、以MF3、MB3、MFIP、MBIP为引物构建LAMP检测体系；LAMP检测体系于64℃恒温水浴中反应40min，反应结束后向反应液中加入1 uL荧光染料SYBR GREEN Ⅰ；若反应液变成绿色，说明待测肉品中存在猫肉；若为橘黄色，则待测肉品中不存在猫肉；

所用引物如下：

MF3: CACTTCCTAGGCCTGTCC，如SEQ ID NO.1所示，

MB3: ATGTGTGGTACGGAGGAG，如SEQ ID NO.2所示，

MFIP:GAAAGAGCCCATTGAGGAAATCGTAGACGTTATTCTGACTATCCAGAT，如SEQ ID NO.3所示，

MBIP:GTTTTCATAGTGTGAGAAGCTTTCGCAAGATTAGTTGTGGTTAGTTCT，如SEQ ID NO.4所示；

所述LAMP检测体系，总体积为25uL；其组成如下

10umol/L的MF3、MB3各0.5uL，10umol/L 的MFIP、MBIP各4uL，2.5mmol/L的 dNTP4uL，50mmol/L的 MgSO₄ 2uL，5mol/L的Betaine2.5uL，Bst DNA聚合酶1uL，10×Thermobuffer 2.5uL，模板2uL，余量为超纯水。

本发明的检测方法与传统PCR相比，在普通恒温水浴锅中反应40 min即可完成，而且可以通过在终产物中加入染料的方法直接用肉眼观察结果，能快速准确地鉴定出动物源性成分；具备操作简便、对实验仪器要求较低、结果判定容易的优点。 本发明无需借助于大型的昂贵仪器设备，更适合于基层的现地检测，具有广阔的市场前景和较大的社会经济效益。