[发明专利]一种缺齿蓑藓ISSR‑PCR分子标记方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其是涉及一种缺齿蓑藓ISSR-PCR分子标记方法。

背景技术

木灵藓科(Orthotrichaceae)蓑藓属(Macromitrium Bridel)是泛热带分布的类群。中国的蓑藓属植物种类非常丰富，缺齿蓑藓(Macromitrium gymnostomum)是其中的一大种类，因蒴帽无齿故名为缺齿蓑藓，该种主要特点是主茎匍匐蔓生，密生红棕色假根；枝条直立，单一或有数个小短枝，长达5.0mm。叶片中部细胞透明，长方形，厚壁，平滑；上部细胞略不透明，圆形，具不明显的疣。枝叶干燥时卷曲，湿润时线形，线状披针形或卵状披针形，孢蒴直立，椭圆状圆柱形，具有皱缩，蒴齿缺失。蒴帽兜形，长1.7-2.0mm，偶尔长仅1.5mm，基部很宽，多少分裂和具皱褶，无毛。具有棕红色的由4-10个细胞组成的条状无性芽胞。Sullivant,William Starling于1859年在Proceedings of the American Academy of Arts and Sciences首次发表该种的命名文章。苔藓植物是植物界的拓荒者之一，在植物界系统演化过程中具有特殊的地位。苔藓植物作为生态系统重要的组成部分，对岩石风化、土壤有机质积累、森林沼泽化等具有重要的生态学功能，而且其在环境保护、药用、园艺等领域以及在生态学、植物化学、细胞遗传学等学科中的科研价值也日益受到关注。随着DNA分子标记技术的发展，人们已将这一技术广泛的应用于种类的鉴定、多样性分析等方面。

目前DNA分子标记技术已发展到十余种，常用手段包括RAPD、ISSR、AFLP、SRAP等。ISSR(inter-simple sequence repeat,简单序列重复区间扩增多态性)是由加拿大Zietkiewicz等提出的，其原理是利用锚定的微卫星为引物，扩增间隔不是很大的两个SSR间的序列，再通过凝胶电泳条带分析样本DNA多态性。ISSR分子技术的优点是无需预先知道基因组的任何信息就可以进行标记，可以在生长周期的任何阶段进行检测，而且引物设计容易，成本低，DNA用量少，因此被认为是一种比较理想的分子标记方法。ISSR分子标记技术现已被广泛应用于许多被子植物的遗传多样性分析中，但对于苔藓植物的研究不是很多，仅见Skotnicki对黄瓜丝藓、刘丽等对鼠尾藓以及李倩影对小羽藓属的遗传多样性的研究，对于ISSR标记法使用较少，国内见于汪琛颖等对狭叶大边藓、真藓科以及王莹莹对浙江千岛湖大灰藓、东亚小金发藓遗传多样性的研究。

因此，对缺齿蓑藓的研究和其他的种类比较还有差距，建立一个相对科学合理有效的ISSR-PCR反应体系，探寻最佳的处理组合，可以为后续的科学研究提供很好的技术指导和理论支持。

发明内容

本发明的目的就是为了提供一种缺齿蓑藓ISSR-PCR分子标记方法，以填补现有技术的空白。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种缺齿蓑藓ISSR-PCR分子标记方法，包括以下步骤：

1)提取缺齿蓑藓的基因组DNA；

2)进行ISSR-PCR扩增。

步骤2)进行ISSR-PCR扩增的反应体系为：30μL反应体系中含有10×LA PCR缓冲液3μL，模板DNA50ng，Mg²⁺为1.5mmol/L，dNTP为0.25mmol/L，Taq酶为1.5U，引物为0.5μmol/L。

所述的引物选自SEQ ID No.1～10中的任一条，具体如下表所示：

步骤2)进行ISSR-PCR扩增的条件为：94℃退火4min，然后94℃45S、53℃45S、72℃1min 40个循环，最后72℃延伸10min。

步骤2)进行ISSR-PCR扩增的循环数为25-45，优选为40。

与现有技术相比，本发明所建立的缺齿蓑藓ISSR-PCR反应体系扩增出的条带稳定性高，清晰度高，具有很高的多态性的特点。弥补了国内对缺齿蓑藓遗传多样性研究的不足，发明的成果可用于缺齿蓑藓遗传关系、分子标记以及生物地理学方面的研究具有很大的科学价值和应用价值。

附图说明

图1为ISSR-PCR探索性正交试验设计反应体系的扩增结果；

M表示：DL2000Marker；引物为UBC834；1-9为表3的处理组合1-9；

图2为ISSR-PCR细调性正交试验图；