[发明专利]辣椒萎黄病病毒检测引物和探针

说明书

技术领域

本发明属于一种基于DNA体外扩增技术的植物病毒分子生物学检测方法，涉及针对布尼亚病毒科（Bunyaviridae）、番茄斑萎病毒属（Tospovirus）的辣椒萎黄病病毒（Capsicum Chlorosis Virus）的检验检疫和分子生物学研究领域。

背景技术

目前，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，简称PCR）技术（参见美国专利4,683,195、4,683,202、4,965,188）在分子生物学研究和检测技术领域的应用非常普遍，相关技术资料可以参考分子克隆-实验手册(Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，New York) 等文献。

辣椒萎黄病病毒（Capsicum Chlorosis Virus，CaCV）感染茄科植物，花生，蝴蝶兰（Phalaenopsis）等，是严重危害兰花养殖业的RNA植物病毒之一。CaCV最先由台湾学者发现感染蝴蝶兰，并很快被欧洲、澳大利亚等国列入兰花贸易待检病毒清单。CaCV最主要的病征是在受到侵害的植株叶面位置产生黄化轮斑，但它并不导致全株植物组织带毒。CaCV可以但不易通过机械接种、嫁接、组织切片等方式传播，这种病毒主要是通过蓟马以永续型方式传播。传播CaCV的蓟马种类尚未澄清。

CaCV属于番茄斑萎病毒属（Tospovirus）的第五血清群，或WSMoV血清组。病毒粒子为球状，直径80~110nm，粒体外层由一层脂质包裹。病毒基因组属于负单链RNA，由L RNA、M RNA、和S RNA三个片段RNA组成。L RNA 为大小约8.92kb的负链、含单个开放阅读框架（ORF），编码依赖RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA Polymerase）。M RNA 和S RNA 均为双义RNA, 有2 个ORF，反向相连。M RNA 大小约4.82kb，编码非结构蛋白NSm（Nonstructural Protein NSm）和糖蛋白前体（Glycoprotein Precursor）。S RNA 大小约3.48kb，编码非结构蛋白NSs（Non-structural Protein NSs）和核衣壳蛋白N (Nucleocapsid Protein)。

国内目前对CaCV的检测主要以血清学方法和分子生物检测法为主。血清学方法包括免疫电镜法（Immuno-specific Electron Microscopy, ISEM）、免疫扩散法 (SDS-immunodiffusion Test)、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫斑点试验(Immunoblotting Test)、胶体金标记层析技术(Gold Immunochromatography Assay，GICA)等；分子生物检测法包括斑点杂交法（Dot Hybridization）、印痕杂交法（Southern Blot或Northern Blot）、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）等。上述方法中，基于对检测灵敏度和快速简单的要求，以RT-PCR最为适用并且在实际工作中应用最广。RT-PCR法具有极高的检测灵敏度，非常适合于样本的快速检测要求。目前常用于对名贵花卉品种的检查。

发明内容

发明目的：本发明的目的就是提供一种适用性广、特异性好、扩增效率高的引物和探针序列，以便对CaCV进行简易快速的田间检测或实验室检测。

本发明的原理如下：本发明以CaCV非结构蛋白（Nonstructural Protein）基因的Ph segment S序列（GenBank: KC953852.1）为靶序列，通过序列比对找出具有高度相似度的片段区间，通过序列分析排除二级结构和非特异性序列区间，最终筛选出的扩增片段位于靶序列第3041～3277碱基，产物大小为237bp。

本发明所涉及引物以及寡核苷酸探针的序列如下（自左至右按5’端到3’端方向排列）：

上游引物：GGT GCA AGG CCT TTA ATG CTG GA

下游引物：GAG GAT TGG ACT TTT AAG AGA A

寡核苷酸探针：A TGT GCT CTC AGG ATG A

上述寡核苷酸探针的5’端可以增加一个5～25mer的poly(dT)结构，以便更高效地将该寡核苷酸探针的5’端固定在载体表面并提高探针的杂交效率。