[发明专利]花生过敏源蛋白的特征肽及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及食品检测技术领域，尤其涉及一种花生过敏源蛋白的特征肽及其应用。

背景技术

花生也是一种常见的过敏源食物，由它引起的过敏反应占食物过敏的1％～20％。目前，公认的花生致敏蛋白有13种。其中，Ara h1和Ara h2是主要花生过敏源，分别约占花生蛋白总量的12～16％和5.9-9.3％，都能被90％以上的花生过敏患者血清所识别。Ara h1在天然状态下主要是以单聚体和三聚体形式存在的水溶性蛋白，包含23个线性IgE结合位点。Ara h2存在两种异构体，包含10个线性IgE结合位点。Ara h2稳定性高、耐酶解，主要原因是Ara h2含有大量二硫键，用以保持其结构稳定。Ara h2具有典型的胰蛋白酶抑制剂的结构，并且经过烘烤处理后，Ara h2蛋白的抑制剂活性被显著提高。

目前，检测食物中花生过敏源成分主要有2种方法。一种是基于DNA检测的方法，如聚合酶链式反应(PCR)。该方法灵敏度高，特异性强，但是由于不直接检测致敏蛋白，故无法进行定量分析。此外，现代食品工业可以将蛋白质和DNA完全分离开来，所以PCR法有假阴性的风险。另外一种基于蛋白的检测方法，如酶联免疫法(ELISA)。此方法也具有高灵敏度、高特异性等特点，但该应用方法在热加工食品中的检测结果通常会低于真实值，主要因为热处理会使蛋白质变性，降低蛋白质溶解度，同时改变蛋白质表面位点，使其不易被抗体正确识别。此外，ELISA法采用抗原抗体技术不可避免会产生交叉反应，导致假阳性现象，也会影响最终检测结果。

现阶段有人尝试将蛋白质组学与液质联用技术运用到对蛋白质的定性定量分析中。Heick等(Heick，J.，M.Fischer，and B.First screening methodfor the simultaneous detection of seven allergens by liquid chromatography mass spectrometry.Journal of Chromatography A，2011.1218(7)：p.938-943)和Shefcheck等人(Shefcheck，K.J.and S.M.Musser，Confirmation of the allergenic peanut protein，Ara h1，in a model food matrix using liquid chromatography/tandem mass spectrometry(LC/MS/MS).Journal of agricultural and food chemistry，2004.52(10)：p.2785-2790)先后建立应用酶解技术和液质联用技术检测花生过敏蛋白的方法。Lutter P等(Lutter，P.，V.Parisod，and H.Weymuth，Development and validation of a method for the quantiftcation of milk proteins in food products based on liquid chromatography with mass spectrometric detection.Journal of AOAC International，2011.94(4)：p.1043-1059.)在检测过程中，在预处理结束后加入了稳定同位素标记的特征肽作为内标，以校正基质效应对质谱离子化带来的影响。Zhang等(Zhang，J.，et al.，Determination of bovine lactoferrin in dairy products by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry based on tryptic signature peptides employing an isotope-labeled winged peptide as internal standard.Analytica chimica acta，2014.829：p.33-39.)和Chen等(Chen，Q.，et al.，Quantification of bovine β-casein allergen in baked foodstuffs based on ultra-performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry.Food Additives&Contaminants：Part A，2015.32(1)：p.25-34)人在稳定同位素标记的特征肽的基础上，根据蛋白质原有序列，向氮端和碳端各延长了6-8个氨基酸。该多肽在酶解之前加入样品中，可在酶的作用下形成同位素标记的特征肽，所以它除了能对离子化过程进行校正之外，还能校正基质对酶切过程造成的干扰，使建立的方法较之前的方法更加准确可靠。