[发明专利]检测金黄色葡萄球菌及mecA的引物、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测检测金黄色葡萄球菌及耐药基因mecA的引物；本发明还涉及一种包括上述引物的用于检测金黄色葡萄球菌及耐甲氧新林耐药基因mecA的双重荧光PCR检测试剂盒，本发明还涉及一种采用上述试剂盒检测金黄色葡萄球菌及耐甲氧新林耐药基因mecA的方法。

背景技术

葡萄球菌是革兰氏阳性球菌中的一种，广泛分布于自然界，如空气、水、饲料和一些食品中，也存在于人和动物的体表、鼻咽部及肠道。致病性葡萄球菌常引起各种化脓性疾患、败血症或脓毒败血症，当污染食品时，可引起食物中毒。1974年葡萄球菌属分为三种:金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌脚。其中金黄色葡萄球菌staphylococcus.aureus致病力最强，也最重要。金黄色葡萄球菌除了常引起皮肤、组织及器官的化脓性炎症外，其产生的肠毒素可沾染食物而致食物中毒。

由于抗生素的使用，细菌也为了自身发展而不断变异，就形成了细菌对抗菌药物的耐药性，使本来有效的抗菌药物在遇到耐药菌引起的感染时疗效下降甚至完全无效。金黄色葡萄球菌至今仍然是国内外医院获得性感染最常见的细菌之一。随着β-内酞胺类抗生素在临床的广泛应用，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA在临床分离的葡萄球菌中比例不断增加，MRSA几乎对所有β-内酞胺类抗生素都耐药。1996年，又出现了首例对万古霉素敏感性下降的MRSA。一旦对万古霉素耐药，临床可选用药物将非常有限，从而造成治疗上的困难。研究可靠的检测方法，对其准确、及时的检出，对于控制耐药菌的播散极为重要。

本发明选择的目的基因为谷氨酸铁还原合成酶glutamate synthase-ferredoxin large subunit,gltB，序列同源性相对保守，能够较好的将金黄色葡萄球菌和其他食源性致病菌进行区分。也是1870-2007《食品中致病菌检测方法实时PCR法》中检测金黄色葡萄球菌的靶基因。

本发明选择的另外一个目的基因为mecA基因，该基因负责编码青霉素结合蛋白2a(PBP2a)，它降低β-内酰胺抗生素亲和力，而PBP2a与固有的PBP2共同作用，使得细菌尽管在β-内酰胺抗生素的环境中也能合成细胞壁，使细菌对青霉素、头孢菌素和碳青霉烯类抗生素耐药。mecA基因位于葡萄球菌染色体mec盒staphylococcal cassette chromosome mec简称SCC mec侧面DNA的特有片段上。SCC mec是一个携带mec基因复合体的可移动基因岛genomic islands，GI，甲氧西林耐药和其他抗生素耐药基因在此不断积累，形成耐药岛resistance island，RI，导致MRSA对抗生素双重耐药。

传统细菌耐药性方法虽然能够满足临床的部分需要，但这些方法仍然存在一些缺点，例如检测时间较长和检测结果不够准确等。因此，随着分子生物学技术在临床检验领域的应用近年来发展了一系列快速细菌鉴定或分子检测技术，这类方法的特点是快速而准确，一般在几个小时之内就可以得到检测结果，大大缩短了检测时间。针对金黄色葡萄球菌和mecA相关基因，研究人员已开展了常规PCR和荧光PCR方法研究，但常规PCR方法需要PCR扩增后进行电泳，不仅操作繁琐，而且容易引起污染，还需要使用可能致癌的荧光燃料，而探针法荧光PCR方法虽然灵敏准确，但是其检测成本较高，而且试剂有效期短，很容易降解。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种用于检测金黄色葡萄球菌及mecA用的引物；

本发明的另一个目的是提供一种包括上述引物且组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确，适用于双重荧光PCR检测金黄色葡萄球菌及耐甲氧新林耐药基因mecA的试剂盒；

本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测金黄色葡萄球菌及mecA基因的方法，该方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。

为了达到上述目的，本发明采用以下方案：

一种检测金黄色葡萄球菌及mecA用的引物，其特征在于该引物的序列分别为：

上游引物gltBF：TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC

下游引物gltBR：GGATAATGAAGGGAAACC

上游引物mecAF：GTTGTAGTTGTCGGGTTT

下游引物mecAR：TTTATCGGACGTTCAGTC。

一种检测金黄色葡萄球菌及mecA用的试剂盒，其特征在于该试剂盒中20μL反应体系包括以下组分：