[发明专利]检测金黄色葡萄球菌及mecA的引物、试剂盒及方法

权利要求书

1.一种检测金黄色葡萄球菌及耐药基因mecA用的引物，其特征在于该引物的序列分别为：

上游引物gltBF：TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC

下游引物gltBR：GGATAATGAAGGGAAACC

上游引物mecAF：GTTGTAGTTGTCGGGTTT

下游引物mecAR：TTTATCGGACGTTCAGTC。

2.一种检测金黄色葡萄球菌及耐药基因mecA用的试剂盒，其特征在于该试剂盒中20μL反应体系包括以下组分：

其中所述上游引物gltBF的序列：TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC

所述下游引物gltBR的序列：GGATAATGAAGGGAAACC

所述上游引物mecAF的序列：GTTGTAGTTGTCGGGTTT

所述下游引物mecAR的序列：TTTATCGGACGTTCAGTC。

3.根据权利要求2所述的一种检测金黄色葡萄球菌及mecA用的试剂盒，其特征在于该试剂盒中20μL反应体系包括以下组分：

4.一种检测金黄色葡萄球菌及mecA的方法，其特征在于包括以下步骤：

A、提取样品DNA；

B、利用如权利要求2或3所述的试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增；

C、扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。

5.根据权利要求4所述检测金黄色葡萄球菌及mecA的方法，其特征在于步骤B中PCR扩增的反应程序按以下步骤进行：

(1)92℃～96℃预变性30s；

(2)92℃～95℃变性10s～30s，54℃～64℃退火10s～30s，72℃10s～30s，共进行35～45个循环；

(3)72℃延伸10s～30s。

6.根据权利要求5所述检测金黄色葡萄球菌及mecA的方法，其特征在于步骤C中所述高分辨率熔解曲线分析，按以下步骤进行：

(1)92℃～96℃变性1min；

(2)40℃复性1min；

(3)然后初始熔解温度60℃～65℃，开始程序升温熔解至90℃～95℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，15～25次/秒。

7.根据权利要求6所述检测金黄色葡萄球菌及mecA的方法，其特征在于步骤A中所述提取样品DNA的具体步骤如下：

取1.5mL培养物10000rpm离心2min；沉淀物加入500μL的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，8000r/min离心3min，去尽上清，向沉淀中加入200μl的50mg/mL的溶菌酶溶液、30μL 10％SDS和15μL的蛋白酶K，涡旋混匀后，于37℃温育1h；加入100μL的5mol/L NaCl，充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min，将上清转入一只新管中，加入0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来；沉淀用1mL的70％乙醇洗涤后，加入TE溶液溶解沉淀。