[发明专利]LAMP技术鉴别鱼翅真伪用的引物及方法

权利要求书

1.一种用LAMP技术鉴别鱼翅真伪的方法，其特征在于包括以下步骤：

A、鱼翅DNA的提取采用纳米磁珠提取鱼翅DNA；

B、建立LAMP反应体系25μL的LAMP反应体系包括20μL预反应溶液和5μL DNA模板，其中20μL预反应溶液，由以下组分组成:

2X反应缓冲液12.5μL，引物2-4μL，荧光目视检测试剂1.0μL，酶溶液1.0μL，去离子水补齐至20μL；

所述引物的序列包括：

正向外引物F3：5'-CAGGATTTCCTGATCAATG-3’；

反向外引物B3：5'-GTGTGAACTCAGATCACGT-3’；

正向内引物FIP：

5'-AACCCTTTCTTCGATAGGGACTC-AACCAAGTTACCCTAGGGATA-3’；

其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2序列：

F1c：AACCCTTTCTTCGATAGGGACTC；

F2：AACCAAGTTACCCTAGGGATA

反向内引物BIP：

5'-TACGGCCTCGATGTTGGATC-AGGACTGTTAATCGTTGAACAA-3’

所述反向内引物BIP包括含B1c和B2序列：

B1c：TACGGCCTCGATGTTGGATC；

B2：AGGACTGTTAATCGTTGAACAA；

C、向Loopamp反应试管中分别加入上述预反应溶液各20μL；

D、在预反应溶液中加入待检测的待检测样品DNA 5μL，使总量达到25μL；

E、对照反应中，阴性对照反应使用普通鲤鱼DNA 5μL，空白对照反应使用去离子水5μL，阳性对照使用鱼翅本身提取的DNA 5μL；

F、用移液器吸排液法混合，或者合上盖子轻击使溶液充分混合后瞬时离心；

G、将混合物置于LAMP浊度仪的反应孔中，于60-70℃恒温反应90min，最后60-80℃下保温5min以结束反应；

H、采用LAMP浊度仪方法或荧光目测的方法检测检验结果,

所述(正向外引物F3+反向外引物B3)：(正向内引物FIP+反向内引物BIP)的浓度比为1:2-1:10。

2.根据权利要求1所述的一种用LAMP技术鉴别鱼翅真伪的方法，其特征在于所述的FIP和BIP各1.6μM，各40pmol；F3和B3各0.2μM，各5pmol。

3.根据权利要求1所述的一种用LAMP技术鉴别鱼翅真伪的方法，其特征在于步骤A中所述的纳米磁珠提取鱼翅DNA具体步骤：

1)制样：将不同鱼翅样品用锉刀磨碎，取磨碎样品0.1-0.5g的鱼翅组织加入1mL抽提缓冲液进行研磨制成样品；

2)清洗纳米磁珠：取出纳米磁珠到PCR管中，用ddH₂O反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH₂O；

3)结合：加入100μL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；

4)清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；

5)裂解：加入50μL ddH₂O到PCR管中,用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95℃，10min；

6)取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为鱼翅DNA。

4.根据权利要求1所述的一种用LAMP技术鉴别鱼翅真伪的方法，其特征在于所述的LAMP浊度仪方法包括有实时浊度检测和/或终点度检测。

5.根据权利要求1所述的一种用LAMP技术鉴别鱼翅真伪的方法，其特征在于所述荧光目测的方法：

使用紫外线照射装置从试管底部向上进行照射，佩戴紫外防护眼镜从试管侧面进行观查；如果与阳性对照一样发出绿光，则判定为阳性，如果与阴性对照一样没有发出荧光，而判定为阴性。