[发明专利]一种单纯疱疹病毒性角膜炎疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，本发明涉及一种单纯疱疹病毒性角膜炎疫苗及其制备方法。

背景技术

单纯疱疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis,HSK)是一种严重的世界性致盲性眼病，主要由单纯疱疹病毒I型(HSV-1)感染引起，它病情迁延、易复发，终身不愈。HSK发病机制主要分为原发感染，潜伏及复发感染：原发感染为HSV-1直接感染角膜上皮细胞引起点状或树枝状角膜炎；原发感染后，HSV-1病毒能顺着神经轴突逆流至局部三叉神经节(TG)，形成潜伏。有报道称病毒可于感染后24小时内到达TG；在机体免疫力低下时,潜伏感染的HSV-1可重新活化,引起复发性感染，多表现为基质性角膜炎(stromal keratitis，SK)，其病情较原发性HSK严重，常由于反复发作而导致失明。HSK在发达国家的发病率为每年5.9/10⁵～20.7/10⁵，患病率为149/10⁵。据调查，在我国角膜盲是仅次于白内障盲而居第二位，而HSK盲为角膜盲首位，约占42.85％，其3年的复发率可达到33.5％。近年来，由于抗生素和皮质类固醇的广泛应用，HSK发病率有逐渐增高趋势。

HSK目前治疗方案主要为：眼局部结合全身口服应用抗病毒药物，对于基质性角膜炎，应用皮质类固醇激素；对于潜伏期患者给予预防用药：长期口服抗病毒药物，甚至终身服用。以上治疗可以一定程度地减轻HSK的症状以及控制HSV-1感染的复发，但不能避免HSK的发病，更无法有效清除处于潜伏期的病毒，也就不能达到根治。用药期间病毒易脱落仍可造成传播，且药物的长期使用，对患者不论从经济上还是心理上都是一个很大的负担；另一方面，由于抗病毒药物的长期使用，使病毒耐药株不断出现，疗效继而受到影响，而且将产生一定程度的副反应。针对病毒的特异性主动免疫是控制HSV-1感染的最有效途径，有初步研究表明,在动物中能一定程度预防病毒原发感染及控制复发感染,表明研制和接种安全有效的抗HSK的疫苗，具有重要的应用前景。

发明内容

针对上述背景技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种单纯疱疹病毒性角膜炎疫苗，以安全有效的防治单纯疱疹病毒性角膜炎。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种单纯疱疹病毒性角膜炎疫苗，由质粒pRSC-gD·gC-IL-21构成,采用纳米壳聚糖包裹；其中，gC与gD分别为单纯疱疹病毒I型的主要包膜糖蛋白之一，均采用胞外区基因组，IL-21为免疫佐剂。

所述质粒pRSC-gD·gC-IL-21的浓度为5μg/μl。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述单纯疱疹病毒性角膜炎疫苗的方法，其技术方案如下：

一种制备单纯疱疹病毒性角膜炎疫苗的方法，包括如下步骤：

(1)HSV-1gD；gC基因的获取；

(2)pRSC-gC·gD-IL-21质粒的构建；

(3)制备壳聚糖/质粒DNA纳米疫苗。

进一步的，所述步骤(1)包括：

(1a)细胞和病毒的培养；

(1b)HSV-1基因组DNA的提取；

(1c)PCR扩增gC；gD基因；

(1d)gC，gD基因的检测与凝胶回收。

进一步的，所述步骤(1a)包括：

(1a-1)RPMI 1640培养基的制备；

(1a-2)细胞培养：将绿猴肾传代(Vero)细胞复苏后传代；

(1a-3)病毒的培养：接种HSV-1病毒悬液于Vero细胞中，培养基为胎牛血清(FCS)体积含量为10％的RPMI 1640，收获感染病毒的细胞，并离心，其上清含有病毒，TCID50滴定后-70℃保存备用；细胞沉淀用于HSV-1基因组DNA的提取。

进一步的，所述步骤(1b)包括：设计引物，PCR扩增获得gC；gD基因。

进一步的，所述步骤(2)包括：

(2a)构建pRSC-gD-IL-21质粒；

(2b)构建pRSC-gD-Linker-IL-21质粒；

(2c)构建pRSC-gD.gC-IL-21融合表达质粒。

进一步的，所述(2a)构建pRSC-gD-IL-21质粒、(2b)构建pRSC-gD-Linker-IL-21质粒的步骤包括：

(2ab-1)制备LB培养基；

(2ab-2)酶切、连接获得pRSC-gD-IL-21质粒并筛选鉴定；