[发明专利]一种单纯疱疹病毒性角膜炎疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种单纯疱疹病毒性角膜炎疫苗，其特征在于：由质粒pRSC-gD•gC-IL-21构成, 采用纳米壳聚糖包裹；其中，gC与gD分别为单纯疱疹病毒I型的主要包膜糖蛋白之一，均采用胞外区基因组 ，IL-21为免疫佐剂。

2.如权利要求1所述的单纯疱疹病毒性角膜炎疫苗，其特征在于：所述质粒pRSC-gD•gC-IL-21的浓度为5 µg/µl。

3.一种制备权利要求1或2所述的单纯疱疹病毒性角膜炎疫苗的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）HSV-1 gD；gC基因的获取；

（2）pRSC-gC•gD-IL-21 质粒的构建；步骤（2）包括：

（2a）构建pRSC-gD-IL-21 质粒；

（2b）构建pRSC-gD-Linker-IL-21质粒；

（2c）构建pRSC-gD•gC-IL-21 融合表达质粒；

所述（2a）构建pRSC-gD-IL-21 质粒、（2b）构建pRSC-gD-Linker-IL-21质粒的步骤包括：

（2ab-1）制备LB培养基；

（2ab-2）酶切、连接获得pRSC-gD-IL-21 质粒并筛选鉴定；

（2ab-3）将纯化的gD-Linker基因片段和pRSC-gD-IL-21分别进行酶切反应，回收纯化，鉴定后，以紫外分光光度计定量两种双酶切产物的量；

（2ab-4）质粒和目的基因片段的连接：将上述的酶切产物gD-Linker和质粒pRSC-IL-21进行连接反应；

（2ab-5）制备新鲜感受态细菌及转化：接种Ecoli DH5α单菌落于LB培养基，于37 ^oC培养，转速250 rpm过夜；转种过夜培养菌液于LB培养基，37℃培养至细菌密度OD ₆₀₀为0.4，取菌液至离心管，于4 ^oC，转速4000 rpm下，离心10 min，弃上清；加入75 mM CaCl₂混匀，冰浴30 min；于4 ^oC，转速4000 rpm，离心10 min，弃上清；加75 mM CaCl₂重新混匀，此即为新鲜的感受态细菌；另取离心管，加连接反应液，再加新鲜感受态细菌，混匀，冰浴30 min；于42^{oC水浴100 s，再冰浴2 min；加LB培养基，于37 oC下 1 h后，取涂布于含100 µg/ml Amp的LB平皿，37 oC培养过夜；}

（2ab-6）重组质粒PCR鉴定：在培养的转化菌平板上随机挑取8个大小均匀一致的克隆进行PCR鉴定 ，所得产物以1.2% 琼脂糖电泳检测；

（2ab-7）重组质粒酶切鉴定：上述PCR产物阳性之克隆移入LK液体培养基中，于37℃恒温振荡细菌摇床中250 rpm培养12小时，抽取质粒后，按设计好的反应体系进行酶切反应，分别取 DNA Marker、酶切产物后，100v电压电泳30 min后观察结果；

所述步骤（2c）包括：

（2c-1）酶切反应：将纯化的gC基因PCR产物片段和质粒pRSC-gD-Linker-IL-21分别进行酶切反应；

（2c-2）连接反应：将上述的酶切产物gC DNA片段和质粒pRSC-gD-Linker-IL-21进行连接反应；

（2c-3）制备新鲜感受态Ecoli DH5α细菌及转化；

（2c-4）PCR鉴定：在培养的转化菌平板上随机挑取8个大小均匀一致的克隆进行PCR鉴定 ，所得产物以1.2% 琼脂糖电泳检测；

（2c-5）重组质粒的酶切鉴定 ：上述PCR产物阳性之克隆进行酶切反应，分别取 DNA Marker、酶切产物，100v电压电泳30 min后观察结果；

（2c-6）阳性克隆测序；

（3）制备壳聚糖/质粒DNA纳米疫苗。

4.如权利要求3所述的制备单纯疱疹病毒性角膜炎疫苗的方法，其特征在于：所述步骤（1）包括：

（1a）细胞和病毒的培养；

（1b）HSV-1基因组DNA的提取；

（1c）PCR扩增gC；gD基因；

（1d）gC，gD基因的检测与凝胶回收。