[发明专利]同时检测多种动物源性成分的试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及动物分子生物学领域,具体涉及同时检测多种动物源性成分的试剂盒及其应用。

技术背景

随着市场经济的不断发展，一些不法商贩为了谋取不正当的利益，在血制品、肉制品中掺杂一些价格便宜的肉种甚至有挂羊头卖狗肉的行为存在。有调查研究表明，这种掺假的现象在市场上已经普遍存在，大部分肉制品中都掺有相对比较便宜的肉种，甚至全部是价格便宜的肉种，这极大的损害了消费者的利益，扰乱了市场秩序，危害市民的健康。

并且口蹄疫、疯牛病、禽流感、羊瘙痒病等动物源传染病频发，疫情区域内的动物源性成分鉴别显得尤为重要；为了防止疫情扩散，维护广大消费者的切身利益，也需要一种快速有效的动物源性监测方法。

但是，因血制品和肉类的同源性因此难以直接分辨，目前已有的动物源性成分鉴别方法都存在一定的缺陷（显微检测方法：难以区分动物源性、免疫学检测方法：工艺繁琐及灵敏特异性低、近红外光谱检测方法：需要大量有权威性的标准样品、实时荧光定量检测方法通量低且容易出现假阳性）。目前检测监测机构没有一种快速有效的检测方法，对肉制品中的动物源性成分做出鉴定，致使此类现象难以判断和裁决。为了规范市场秩序，维护消费者的正当权力和利益，保证市场竞争的公正性，急需一种快速全面准确的检测方法来判断此类现象。

大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌。其食品卫生学意义是作为食品是否被粪便污染的指示菌，广泛被我国和国外许多国家应用于食品卫生质量检验。虽然肠道致病菌是引起食物中毒的主要来源，但由于大肠杆菌与致病菌的来源相同，只要食品检出大肠杆菌，说明有粪便污染，被认为不卫生。本发明，包含11对不同动物来源的特异性引物，并包含一对大肠杆菌引物作为血液、血制品及肉类，肉制品是否有粪便污染的现象存在。

专利201310082539.1和201310368498.2提供的检测系统仅可检测1种和4种肉类源性，适用范围有很大的限制。

微卫星（Microsatellite），又称简单序列重复（Simple sequencerepeats,SSR），是指少数几个核苷酸（一般为1-6个）为重复单位组成的简单多次串联重复序列，其长度大多在100bp以内。由于微卫星具有高度的多态性,在基因组中含量丰富且分布均匀等优点，而且微卫星DNA所在区域在生物的基因组中是比较保守的，某一物种的微卫星引物可在相关密切的物种中使用，因此微卫星标记技术的应用非常广泛。STR位点相对线粒体细胞色素氧化酶b（Cytb）物种间的特异性更加好，扩增特异性较好，在样本浓度高时，依然可以做到特异性较高，避免了Cytb序列物种间序列高度相似，无法复合扩增及高浓度样本易出现假阳性结果的缺陷。

毛细管电泳检测具很高的灵敏度，最低可检测31-62.85pg的基因组DNA，相当于10-20个拷贝的人类基因组。并且可同时检测的位点数量比实时荧光定量检测多，通量更高。

发明内容

本发明的目的是提供一种同时检测多种动物源性成分的试剂盒及其应用，采用荧光引物复扩和毛细管电泳方法结合，快速有效的对动物源性成分检测，可以同时检测犬、牛、羊、鱼、猪、鸭、鸡、兔、猫、马、鼠和大肠杆菌的动物源性成分。

本发明采用的技术方案：

在12种种属的序列STR保守区域设计12对特异性引物分别扩增犬（PEZ1）、牛（BM2113）、羊（MAF33）、鱼（HLJ392）、猪（SW742）、鸭（CAUD056）、鸡（MCW248）、兔（Sat7）、猫（FCA955）、马（HMS3）、鼠（cds）和大肠杆菌（CFS073），检测样本DNA中是否含有这12种种属的DNA，实现同时鉴别样本多种动物源性成分的目的。

同时检测多种动物源性成分的试剂盒，该试剂盒包括12对用于检测动物源性成分的引物，所述特异性引物由犬（PEZ1）、牛（BM2113）、羊（MAF33）、鱼（HLJ392）、猪（SW742）、鸭（CAUD056）、鸡（MCW248）、兔（Sat7）、猫（FCA955）、马（HMS3）、鼠（cds）和大肠杆菌（CFS073）的特异性引物组成，所述引物序列及其浓度见表1。

表1 引物序列及浓度