[发明专利]鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT‑PCR检测试剂盒，该试剂盒含有两对特异性引物。本发明具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点，应用本发明可建立鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT‑PCR检测方法，实现同时检测和鉴别鸭甲肝病毒1型和3型两种病原体，既可以节约时间的成本，又可以减少污染。

技术领域

本发明属于RT-PCR检测技术领域，尤其涉及一种鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测试剂盒。

背景技术

鸭肝炎是鸭肝炎病毒(DHV)引起的一种传播迅速并对雏鸭具有高度致死性的病毒病，以肝脏肿大及出血为主要发病症状。DHV根据血清型曾被分为Ⅰ型DHV(DHV-1)、Ⅱ型DHV(DHV-2)和Ⅲ型DHV(DHV-3)，但后来又发现，血清Ⅰ型鸭肝炎病毒还存在两个变种，分别是“台湾NDHV”变异株和“韩国NDHV”变异株，且这两个变异株均不与血清Ⅰ型DHV产生交叉中和反应。最新分类将血清Ⅰ型DHV及其变异株重新更名为鸭甲肝病毒(DHAV)，而原来的血清Ⅱ型和Ⅲ型DHV则被更名为鸭星状病毒1型(DAstV-1)和鸭星状病毒2型(DAstV-2)，归属为星状病毒科。传统的血清Ⅰ型DHV和“台湾NDHV”、“韩国NDHV”则被分类为DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3。

目前，我国流行的DHAV主要为DHAV-1和DHAV-3，由于DHAV-1和DHAV-3所导致的鸭病毒性肝炎临床症状和病理变化非常相似，常常不能正确诊断和有效防控而给养殖业造成巨大经济损失。虽然对DHAV-1和DHAV-3传统的检测方法主要有病毒分离、血清学试验、琼脂扩散试验和酶联免疫吸附试验等，但这些方法存在耗时长、敏感性差、难标准化等局限性，更不能有效鉴别是何种DHAV所造成的感染。

PCR技术实现了对模板的定量检测，而且具有敏感、特异、准确可靠、能实现多重反应等特点。在实际应用中，当样品量非常大时，单重PCR在成本和时间方面就存在一定的劣势，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的方法来进行批量的快速检测。二温式PCR是根据经典PCR技术原理，对标准PCR进行改进，把退火和延伸合并为一个温度，比标准PCR退火温度高，不仅提高了反应的特异性，更大大缩短了检测时间。然而，建立二重PCR方法比单重要复杂得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要保证不同引物间无相互干扰。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种操作简便、敏感性高、特异性强、重复性好的鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测试剂盒，以实现同时检测和鉴别鸭甲肝病毒1型和3型两种病原体。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测引物组，包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。

引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为0.5-1∶0.5-1∶1∶1。

引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为1∶1∶1∶1。

上述鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测引物组在PCR扩增方面的非诊断应用，PCR扩增的退火温度为60.0-70.0℃。

PCR扩增的退火温度为65℃。

鸭甲肝病毒1型和3型二重二温式RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒含有以下试剂：

A液：PCR反应液，含2×Taq PCR Mix(购自全式金.AS111-12)、DHAV-1上下游引物、DHAV-3上下游引物、ddH₂O，DHAV-1上下游引物分别是引物1和2，DHAV-3上下游引物分别是引物3和4，引物1至4分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列；

B液：DHAV-1+DHAV-3模板，作为阳性对照；