[发明专利]BRCA1蛋白在制备逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及BRCA1蛋白在制备逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用，具体涉及BRCA1蛋白在制备通过下调DHFR基因扩增进而逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用，属于肿瘤生物治疗技术领域。

背景技术

氨甲蝶呤(Methotrexate,MTX)是恶性肿瘤治疗中的一个有效的抗代谢药，是目前肿瘤治疗中应用最广泛的叶酸拮抗剂，能竞争性地结合二氢叶酸还原酶(Dihydrofolatereductase,DHFR)，抑制核苷酸代谢，从而阻断DNA的合成、特异性地杀伤增殖期细胞。虽然MTX已成为肿瘤治疗的常用药物，但是，由于长时间的用药会导致耐药性的产生，从而严重影响药物的疗效，所以克服MTX耐药是提高其肿瘤治疗疗效的关键。

MTX耐药分为先天耐药和获得性耐药。其中MTX获得性耐药的机制可以概括为以下三类：第一、还原性叶酸载体(Reduced folate carrier,RFC)的缺失或功能缺陷致使MTX的摄入量减少；第二、胞内多聚谷氨酸合成酶(Folylpolyglutamate synthetase,FPGS)活性下降或表达降低导致氨甲蝶呤多聚谷氨酸化水平下降，产生耐药；第三、MTX的靶酶DHFR水平升高导致的耐药，DHFR表达增强通常是由DHFR基因扩增引起的。

基因扩增是指细胞内部某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象，是基因组不稳定性的一种主要形式。基因扩增会形成两种主要的细胞遗传学结构，即染色体外元件双微体(Double minutes,DMs)及染色体上的异常结构均质染色区(Homogeneous staining regions,HSRs)。1962年，人们首次在结肠癌细胞中发现DMs。DMs是染色体外成对环状，能自主复制的染色小体。DMs没有着丝粒，在细胞分裂中随机分配，正因为如此，DMs随时面临着丢失的风险。但是，DMs本身带有的扩增基因或者与耐药相关的基因能为细胞本身提供生长优势，因此在群体中会出现DMs逐渐增多的现象。人们最早在人神经母细胞瘤细胞系及耐MTX的中国仓鼠细胞系中发现了均质染色区。应用G显带技术发现一段缺乏典型带纹的染色体片段，并称其为均质染色区或异常显带区域。

研究发现，包含DHFR耐药基因的DMs数量减少会逆转细胞对MTX的耐药情况。而目前DMs减少的机制还不十分明确。根据实验室前期结果及相关文献报道，我们推测使DMs数量减少的原因主要有以下两种：第一，DMs转化为HSRs；第二，DMs以微核形式外排。目前研究表明，微核外排具有典型的细胞周期依赖性，主要发生在G₀期和M期。因此，细胞周期进程加快可能导致微核外排量增加，进而促进细胞内DMs数量的减少。

基因扩增产生的前提条件是DNA双链断裂(double strands break，DSB)的发生。在此基础上，细胞对于DSB的修复能力异常增加。DSB修复主要存在两种机制，同源重组修复(homologous recombination repair，HR)是其中较为精确的修复机制。因此，HR的异常表达可能会影响肿瘤细胞中基因扩增的程度。

HR的主要参与蛋白包括：PI3K家族成员ATM、剪切酶复合体MRN(MRE11/RAD50/NBS1)、BRCA1、BRCA2、RAD51及其类似物家族、RAD52、RAD54、RecQ解旋酶等。其中，BRCA1是重要的核心分子之一。研究发现，BRCA1不仅可竞争性抑制53BP1，启动HR；它还能与MRN复合体相结合完成DNA末端的剪切；促进RAD51的募集以保证链入侵的顺利进行；此外，它还能够影响细胞周期检查点，是细胞周期的重要调控因子。本研究针对BRCA1进行干扰后发现，细胞内DSB累积急剧增加；研究还发现，干扰BRCA1能够加快细胞周期进程，使含有DHFR扩增基因的微核外排增多，导致细胞内DHFR基因剂量减少，细胞对MTX的耐药能力降低，进而逆转肿瘤细胞的耐药情况，为肿瘤治疗提供新的靶点，为有效地对抗MTX耐药提供科学依据。

发明内容

针对肿瘤治疗药物MTX在治疗过程中常常产生耐药而导致化疗失败甚至疾病复发的现象，本发明提供了BRCA1蛋白在制备逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用，具体涉及BRCA1蛋白在制备通过下调DHFR基因扩增进而逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用。

本发明中，优选的，所述肿瘤细胞为对MTX的耐受程度为10^-4mol/LMTX的人结肠癌细胞。